早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证

目的应用蛋白质组学技术筛选早期肺癌癌变相关蛋白。方法利用双向凝胶电泳方法分离人早期肺鳞癌组织和相应癌旁正常组织总蛋白,选择差异蛋白质点进行质谱分析。免疫组织化学法验证部分差异蛋白质的表达差异。结果用DeCyder软件DIA模块分析显示,每块2-DE胶分离近1470左右个蛋白质点,再经过BVA模块分析,找出在9张图像中均出现,差异有统计学意义(P0.05)、两组间蛋白含量比值在1.5倍以上的差异性蛋白质点24个,成功鉴定14个。选择在癌组织中高表达的差异蛋白点进行质谱分析,最终鉴定为AnnexinⅡ、Cathcpsin D等蛋白质。免疫组织化学检测结果显示,AnnexinⅡ、Cathcpsin D蛋白在肺鳞癌组织中的阳性表达率均显著增高(P0.05)。结论蛋白质组学方法是一种应用于初步筛选早期肺癌相关蛋白的有效方法 ,所鉴定的蛋白为进一步筛选用于肺癌早期诊断及其治疗的分子标志物奠定了前期基础。     

人肺腺癌及癌旁组织的差异蛋白质组学分析

目的通过分析人低分化腺癌、中分化腺癌及癌旁远端正常组织的差异蛋白,寻找与肺腺癌发病相关的蛋白。方法利用双向凝胶电泳的方法分离肺腺癌及癌旁组织的蛋白质,通过图像扫描寻找差异蛋白点,进而应用基质辅助激光电离飞行时间质谱得到肽质量指纹图谱,对比数据库确定差异蛋白。结果人中分化腺癌及癌旁远端正常组织、低分化腺癌及癌旁远端正常组织的平均蛋白点数分别为1810±167、1704±53、2066±144、1549±33。选取差异2倍以上蛋白点进一步分析,发现与肺腺癌相关的蛋白质共14个。结论双向凝胶电泳技术结合基质辅助激光电离飞行时间质谱可鉴定肺腺癌及癌旁远端正常组织的差异蛋白,为早期诊断肺癌,判断预后奠定基础。     

家族性食管癌组织中蛋白质组分析

目的探讨具有家族史的食管癌和正常食管组织内蛋白质组的表达差异,为寻找参与食管癌发生的相关蛋白奠定基础。方法采用双向凝胶电泳分离人食管癌和正常食管上皮组织的总蛋白图谱,经图像分析后,应用蛋白质谱仪对差异蛋白进行鉴定分析。结果食管癌组织中有（45±12）个蛋白为新增蛋白,同时相对正常食管上皮中有（9±3）个蛋白缺失。随机选择其中的18个位点进行质谱鉴定发现,9个蛋白质与肿瘤细胞的增殖、分化和肿瘤转移有关。其中肿瘤组织中特异表达的8个,缺失1个。结论建立了分辨率较高的食管癌组织双向电泳图谱,并识别鉴定出了一些与肿瘤相关的蛋白质,为进一步筛选食管癌特异性的分子标志物奠定了基础。     

血清蛋白质组分析技术筛选肝癌自发抗体

目的采用血清蛋白质组分析技术(SERPA)筛选、鉴定肝癌自发抗体。方法双向电泳分离肝癌细胞系HCCLM3的总蛋白后将其转膜,肝癌、肝炎和正常组血清各8份与膜免疫印迹,图像分析确定不同血清免疫印迹图谱间的差异点及其与双向电泳图谱的对应关系,最后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定。结果建立了高重复性HCCLM3的双向电泳图谱及其肝癌、肝炎及正常组血清的免疫印迹图谱,图谱均点数分别为603、70.75±24.25、68.50±23.44和41.38±15.05,肝癌、肝炎组图谱点数明显多于正常组,但肝癌与肝炎组差异无统计学意义。质谱鉴定确定了核蛋白、细胞骨架、代谢酶及热休克蛋白等五类肝癌自发抗体。结论SERPA是一种高通量筛选、鉴定肿瘤自发抗体的新技术,大量肝癌自发抗体的发现为肝癌进一步的免疫诊断及治疗奠定了基础。     

吲哚美辛对结肠癌细胞成瘤裸鼠作用的蛋白质组学研究

目的研究吲哚美辛对人结肠癌细胞系HCT116成瘤裸鼠蛋白质表达谱的影响，寻找吲哚美辛抗结肠癌作用的相关蛋白。方法应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离吲哚美辛处理组和未处理组HCT116成瘤裸鼠瘤组织的总蛋白，胶体考马斯亮蓝染色，图像扫描获取凝胶电泳图谱后，分析比较两组间差异表达的蛋白质，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得经胶内胰酶酶解的差异蛋白点的肽质指纹图谱，用Mascot软件查询数据库。结果所获双向凝胶电泳图谱分辨率高、重复性好，蛋白质点数约1100，吲哚美辛处理组与未处理组的匹配率分别为96．0％和93．6％。两组间共有31个差异表达蛋白点，吲哚美辛处理组有6个蛋白质点表达上调，25个表达下调。获得18张肽质指纹图，经查询数据库初步鉴定12个蛋白质，多数蛋白与肿瘤增殖、浸润、凋亡和肿瘤免疫等相关，包括半乳糖凝集素-1、膜联蛋白及转录因子等。结论吲哚美辛对HCT116结肠癌细胞成瘤裸鼠的作用可能与多种蛋白直接或间接相关，这些蛋白的研究有助于进一步阐明吲哚美辛抗结肠癌作用机制及肿瘤治疗药物新型靶标的发现。     

应用蛋白质组学技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白作用相关蛋白质

目的 应用比较蛋白质组学方法寻找HBV X蛋白(HBx)作用相关蛋白,揭示HBx在肝细胞痛发生、发展中作用的分子机制.方法 以转染HBx基因的人肝癌细胞株HepG2-Px和转染空白载体的人肝癌细胞株HepG2-P.为研究对象,应用二维凝胶电泳技术分离2种细胞的总蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及电喷雾电离串联质谱对差异表达的蛋白质点进行鉴定,蛋白质免疫印迹法验证部分差异表达的蛋白质在2株细胞中的表达水平.数据比较采用t检验.结果 得到分辨率较高、重复性较好的2株细胞系的二维凝胶电泳图谱,质谱分析共鉴定32个HBx作用相关蛋白,包括25个在HepG2-Px中表达上调的蛋白质,如热休克蛋白90AB1、Bcl-2相关抗原-2,细胞核磷酸化蛋白、细胞内氯离子通道-1、基质金属蛋白酶-3和黑色素瘤相关抗原-12等,7个表达下调的蛋白质,如Wnt-5a等.蛋白质印迹验证了部分差异表达蛋白在2株细胞中的表达水平.结论 筛选出的差异表达蛋白主要涉及宿主细胞的基囚转录、信号转导、细胞生长和增殖、细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和细胞代谢、免疫应答等过程.提示这些与HBx相互作用的蛋白质可能与肝细胞癌的发生、发展相关,为揭示HBx的作用机制提供了线索.     

质谱技术鉴定日本血吸虫可溶性虫卵抗原具有早期诊断价值的蛋白分子

目的 采用二维电泳、 免疫印迹法和质谱技术鉴定日本血吸虫可溶性虫卵抗原 （SEA） 成分中具有早期诊断价值的抗原分子。方法 通过等电聚焦以及十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳对SEA进行二维电泳, 将胶上蛋白质斑点转移到硝酸纤维素膜上, 再分别与日本血吸虫感染前、 后不同时间点的小鼠血清反应, 以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 作为二抗, 进行免疫印迹试验, 寻找SEA中能与血吸虫感染早期血清反应的蛋白斑点。通过高效液相色谱串联质谱 （LC? MS/MS） 分析鉴定其蛋白成分。结果 对血吸虫感染1、 2、 6周以及未感染健康小鼠血清识别SEA的二维电泳免疫印迹图谱进行匹配分析发现, SEA中有2个蛋白斑点能被血吸虫感染后1、 2、 6周小鼠血清识别, 另有3个蛋白斑点仅被血吸虫感染后6周小鼠血清识别。经LC?MS/MS鉴定, 2个被血吸虫感染早期血清识别的SEA蛋白分子分别为热休克蛋白 （HSP70）和葡萄糖调节蛋白 （Grp78/Bip）。结论 SEA中HSP70和Grp78/Bip可能具有血吸虫感染早期诊断价值。     

柯萨奇B3m病毒致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳分析

目的建立双向凝胶电泳体系分析柯萨奇B3m病毒(CVB3m)致小鼠急性心肌损伤过程中的蛋白质组差异,探讨CVB3m致心肌损伤的机制。方法分别提取感染CVB3m第0,4,8及21天的BALB/C鼠心肌组织总蛋白,采取固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白,用Image Master软件进行图像分析。结果心肌组织总蛋白平均抽提浓度为13.9 g/L;获得正常小鼠和急性CVB3m感染鼠不同感染时期(第4,8和21天)心肌组织双向电泳凝胶图谱,图像分析4块胶平均蛋白点数为(792±32)个,匹配率为61.25%±6.25%。随机选定不同感染时期的8个差异表达的蛋白质点,得到了表观相对分子质量和表观等电点等一系列数据。结论获得了CVB3m致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳图谱,建立了该模型的蛋白质双向凝胶电泳数据库,有利于该病毒引起小鼠心肌损伤机制的进一步研究。     

日本血吸虫SIEA28kDa分子抗原的二维凝胶电泳分析

目的分析鉴定日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)28kDa抗原组分.方法用高效液相离子交换法对电泳纯SIEA28kDa抗原组分进一步分离纯化,对获得的色谱纯SIEA28kDa抗原组分进行二维凝胶电泳分析.结果SIEA经双向凝胶电泳分离、银染后获得的SIEA-2D图谱蛋白斑点以pI 3～7和Mw14～66 kDa范围最多.进一步经图象采集、PDQuest 2D软件分析SIEA双向电泳图谱,计算在相同的设定值条件下获取的蛋白质斑点数,测得SIEA-2D电泳图谱平均为(948±89)个蛋白质斑点数.电泳纯SIEA28kDa抗原组分用高效液相离子交换法纯化后,280、220 nm波长色谱图均为一个两侧对称、光滑的高峰曲线,色谱洗脱液对其活性光密度图也为一个两侧对称、光滑的高峰曲线.二维凝胶电泳银染色可见一个显色饱和度高的蛋白质圆斑,免疫印迹分析为一个显色饱和度高的单一圆斑.结论色谱纯SIEA28kDa抗原组分为单一分子,其等电点为5.7.     

吲哚美辛抗人结肠癌细胞系HCT116的功能蛋白质组研究

目的　探讨吲哚美辛 (IN)对人结肠癌细胞系HCT116蛋白质表达谱的影响及其抗结肠癌的作用机制。方法　应用固相 pH梯度双向凝胶电泳 (2 DE)技术分离IN治疗组和对照组HCT116细胞的总蛋白 ,银染显色 ,采用ImageScan扫描获取电子图像 ,ImageMaster 2D图像分析软件分析 2组的2 DE图谱并识别差异表达的蛋白质。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)得到相应的肽质量指纹图谱 ,分析并鉴定差异蛋白质。结果　获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的HCT116细胞系 2 DE图谱 ,对照组蛋白质点数为 12 99± 5 5 ,其匹配率为 94 .2 % ;IN治疗组蛋白质点数为 12 0 8± 4 7,其匹配率为 91.0 %。两组共有 4 5个差异蛋白质点 ,其中 ,治疗组有 9个蛋白质点表达上调 ,34个蛋白质点表达下调 ,2个蛋白质点仅在对照组表达。对差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析发现 ,IN可通过BfL 1蛋白诱导HCT116细胞凋亡 ,并鉴定出一些与细胞凋亡、细胞周期及信号转导相关的蛋白质。结论　IN可通过BfL 1等多种途径诱导HCT116细胞的凋亡并抑制其增殖。     

Comparative proteomics analysis of human gastric cancer

AIM： To isolate and identify differentially expressed proteins between cancer and normal tissues of gastric cancer by two-dimensional electrophoresis （2-DE） and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. METHODS： Soluble fraction proteins of gastric cancer tissues and paired normal tissues were separated by 2-DE. The differentially expressed proteins were selected and identified by MALDI-TOF-MS and database search. RESULTS： 2-DE profiles with high resolution and reproducibility were obtained. Twenty-three protein spots were excised from sliver staining gel and digested in gel by trypsin, in which fifteen protein spots were identified successfully. Among the identified proteins, there were ten over-expressed and five under-expressed proteins in stomach cancer tissues compared with normal tissues. CONCLUSION： In this study, the well-resolved, reproducible 2-DE patterns of human gastric cancer tissue and paired normal tissue were established and optimized and certain differentially-expressed proteins were identified. The combined use of 2-DE and MS provides an effective approach to screen for potential tumor markers.     

Proteome analysis of cultured fibroblasts from type 1 diabetic patients and normal subjects

CONTEXT: Protein profiling of diabetic tissues could provide useful biomarkers for early diagnosis, therapeutic targets, and disease response markers. Cultured fibroblasts are a useful in vitro model for proteome analysis and study of the molecular mechanisms involved in diabetes. OBJECTIVE: The objective of the study was to isolate and characterize the proteins of cultured fibroblasts, obtained by skin biopsy, from long-term type 1 diabetic patients without complications and age- and sex-matched normal subjects as controls. DESIGN: Proteins were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), and the gel images were qualitatively and quantitatively analyzed. Protein identification was performed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. RESULTS: Reproducible protein maps of fibroblasts from diabetic and healthy subjects were obtained. A total of 125 protein spots were isolated and identified, among them 27 proteins not previously reported in published human fibroblast 2-DE maps, including 20 proteins never reported previously in the literature in human skin fibroblasts. Quantitative analyses revealed six protein spots differentially expressed in the fibroblasts from the diabetic vs. the control subjects (P < 0.05), representing glycolytic enzymes and structural proteins. An increase of triosephosphate I isomerase of two splice isoforms of pyruvate kinase and alpha-actinin 4 and a decrease of tubulin-beta2 and splice isoform 2 of tropomyosin beta-chain were detected. CONCLUSIONS: We generated 2-DE reference maps of the proteome of human skin fibroblasts from both normal and uncomplicated type 1 diabetic patients. Differences in glycolytic enzymes and structural proteins were found. The functional implications of the identified proteins are discussed.     

肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析

目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质,从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制,为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索.方法 应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法,比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组.收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本,蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体.建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法,用PD-Quest软件分析差异表达的蛋白质点,然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱,联网到Swiss-Prot蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点,最后用Western blot验证双向电泳结果.蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.与癌旁肝组织相比,肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调,包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调,初步鉴定出了其中17个蛋白质,并用Western blot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果.结论 肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点,这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移,细胞周期调控等方面,为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息.     

人胎儿肝组织形态学及蛋白质组学分析

目的 探讨不同发育时期胎儿肝组织形态学及蛋白质表达谱的差异.方法 胎儿肝组织常规切片、HE染色、光学显微镜下观察肝组织形态.采用基于双向电泳-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的蛋白质组学分析方法,分析早,晚期胎儿肝脏蛋白质表达谱的差异,并与肝癌组织蛋白质表达谱比较;用Mascot软件对差异表达的蛋白质在蛋白质数据库中进行检索并鉴定.结果 早、晚期胎儿肝脏不仅组织形态学上存在明显差异,而且蛋白质表达谱也存在明显差异.与肝癌组织蛋白质表达谱比较,对有差异的和相似的32个蛋白质点进行分析,初步鉴定出26个蛋白质.它们涉及细胞的增殖、凋亡及各种物质代谢等方面.结论 提示肝癌的发生是原始胎儿肝细胞发育分化的重现,在肝癌的发生过程中由于癌细胞遗传特性的紊乱获得了某些胎儿肝细胞的特性.     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.     

肺巨细胞癌细胞与支气管上皮细胞分泌蛋白质的差异分析

目的：分析肺巨细胞癌细胞株95C与支气管上皮细胞株16HBE分泌蛋白质的差异。方法利用双向电泳（2-DE）分离肺巨细胞癌细胞株95C、支气管上皮细胞株16HBE分泌的蛋白质,寻找其分泌的蛋白质的差异。结果通过2-DE建立了较稳定的肺巨细胞癌细胞株95C、支气管上皮细胞株16HBE分泌的蛋白质2-DE图谱。经分析,两细胞株共有7个差异蛋白质点,肺巨细胞癌细胞株特有的差异点4个,量下调的差异点3个。结论差异蛋白质的鉴定为确定肺癌早期诊断相关蛋白标志物奠定了基础。     

Comparative Proteomics of Sera From HCC Patients With Different Origins

Background:

Hepatocellular carcinoma (HCC), a major fatal cancer worldwide, is induced by different etiological factors in the liver.

Objectives:

To gain insight into serum protein profiling of HCC with different etiologies.

Patients and Methods:

We subjected the sera of HBV-HCC, HCV-HCC, non-B non-C-HCC patients, and healthy volunteers to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Results:

We found 30 differentially expressed protein spots (≥ 1.5 fold P < 0.05) between these two analyses; of them 17 protein spots corresponding to 8 proteins were identified by MS. Transthyretin, leucine rich α-2-glycoprotein, and ficolin 3 were differentially expressed between HBV-related HCC and non-B non-C-HCC sera. Moreover, haptoglobin α-2 isoforms were decreased in HCV-HCC compared to non-B non-CHCC.

Conclusions:

Serum proteome analyses of HCC with different origins showed a differential protein pattern, presumably related to different hepatopathogenesis in liver induced by different agents. Further studies are required to clarify the importance of identified proteins for early diagnosis of HCC with different origins.     

大鼠急性肺栓塞血清差异表达蛋白的研究

目的研究急性肺栓塞（APE）大鼠血清和正常大鼠血清的差异蛋白表达变化。方法采用血栓颈静脉注入法制备大鼠APE模型,采用双向电泳技术找出差异蛋白,用MALDI-TOF技术和生物信息学技术鉴定差异蛋白,并对部分差异表达蛋白采用Western-blot技术作进一步验证。结果大鼠血清蛋白的2-DE胶银染可分离出1 400多个点,考染可达到1 200个点以上。经图像分析得到的24个差异表达蛋白中有12个蛋白得到鉴定。对部分差异蛋白采用Western-blot方法在蛋白水平的验证结果与2-DE结果基本相符。结论采用比较蛋白质组学的方法可以发现APE大鼠血清中的差异表达蛋白,这些差异表达蛋白分子将为我们寻找新的APE血清学标志物提供重要的线索和依据。