AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB／c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果：成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：188、5E1、5E2，其分泌的mAb为IgG1（188）和IgG2a（5E1、5E2）亚类，他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒，其腹水效价在1：10^5～1：10^6。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV，中和效价达1：1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性，型间无交叉反应，证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论：在口蹄疫病毒mAb的研究中，VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1 mAb的成功制备，为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定

目的:对3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力进行测定.方法:用纯化的O型口蹄疫病毒作为包被抗原建立一种检测方法,将3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)制备腹水并纯化,并用建立的检测方法测定3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力.结果:检测方法中抗原、酶标抗体的最佳稀释度分别为1∶800和1∶10 000,单抗的相对亲和力分别为:4A9约在5.242 μg/ml(1∶600),4C3约在0.763 μg/ml(1∶5 000),9F12约在0.127 μg/ml(1∶40 000),即9F12＞4C3＞4A9.结论:用建立的ELISA方法测定了3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力,将为进一步研究口蹄疫病毒而选取合适的单抗提供理论依据.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1。这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。     

抗人精胺氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人精胺氧化酶(SMO)单克隆抗体(mAb),并验证其在Western blot,免疫组织化学等方法中的应用价值.方法:用pET-15b/SMO质粒转化BL2 (DE3)后,IPTG诱导表达带6×His标签的SMO重组蛋白并用Ni-NTA树脂亲和层析纯化.用SMO重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交融合,获得能高效合成和分泌抗SMO mAb的杂交瘤细胞株.所得抗体的特异性和效价用ELISA和Western blot法以及免疫组织化学技术检测.结果:成功建立了稳定分泌鼠抗人SMO的mAb杂交瘤细胞株,获得的mAb效价高、特异性强,可用于ELISA,Western blot,免疫组织化学等分析技术.结论:成功制备出高特异性并能用于多种生物分析技术的SMO mAb.     

抗Ⅳ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制Ⅳ型登革病毒(DENV-4)非结构蛋白1(NS1)特异性的单克隆抗体(mAbs),并鉴定其特异性。方法:在表达具有良好抗原性的重组DENV4-NS1蛋白的基础上,用重组DENV4-NS1蛋白和灭活的DENV-4免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光测定法(IFA)和Western blot分析对mAb的特异性进行鉴定;通过竞争抑制试验对mAb识别的抗原位点进行分析。结果:获得15株特异性针对DENV4-NS1的mAbs,与其他3型DENV的NS1不产生交叉反应。mAb的Ig亚类测定均为IgG1。竞争抑制试验显示,15株mAbs存在2个不同识别抗原位点。结论:成功地获得特异性针对DENV4-NS1蛋白的mAbs,为进一步研究DENV4-NS1蛋白的结构与功能及研制DENV-4的临床诊断试剂奠定了基础。     

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（FMDV）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白（VP1epi）作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。     

抗急性出血性结膜炎病毒受体单克隆抗体的制备与鉴定

用细胞保护试验、间接免疫荧光试验及流式细胞仪等方法，对采用细胞融合技术所得到的抗肠道病毒７０型（Ｅｖ７０）和柯萨奇病毒Ａ２４型变异株（ＣＡ２４ｖ）受体的单克隆抗体进行了研究，发现４株抗Ｈｅｌａ细胞膜受体的单克隆抗体能同时阻断Ｅｖ７０和ＣＡ２４ｖ某些毒株感染ＨｅＬａ细胞。这一结果提示ＥＶ７０和ＣＡ２４存在有相似的受体，对这两种不同的病毒能引起同一种临床疾病的发病机制的阐明有一定的指导意义。     

O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗O1群小川型霍乱弧菌(VibriocholeraeO1serotypeOgawa)特异性单克隆抗体(McAb),为霍乱的早期快速诊断提供有力的抗体工具。方法以灭活的O1群小川型霍乱弧菌免疫Balbc小鼠,通过杂交瘤技术制备针对O1群小川型霍乱弧菌的McAb,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行筛选,分析其亚类,检测其效价及相对亲和力,以间接ELISA和Westernblot鉴定McAb特异性,并进行McAb结合表位分析。结果融合了602株能分泌抗O1群小川型霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株,最后得到5株能稳定分泌特异性的针对该McAb的细胞株,其抗体亚类分别为3株IgG1,1株IgG2b,1株IgG3;腹水效价均达1×10-6;亲和常数在1×108～1×109之间。间接ELISA法及Westernblot证实所获的McAb可与O1群小川型霍乱弧菌发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示除有2株McAb识别相同的抗原表位外,其余均识别不同的抗原表位。结论获得霍乱弧菌O1群小川型特异性McAb,为O1群小川型霍乱早期快速诊断和发病机理的研究提供基础。     

抗MDV-1 VP22羧基端单克隆抗体的制备与免疫学特性鉴定

目的：制备抗血清Ⅰ型马立克氏病病毒（MDV-1）VP22的单克隆抗体（mAb），并鉴定其免疫学特性。方法：在原核系统中表达VP22羧基端区域（94～243aa），获得融合表达产物GST-VP22C。将该表达产物切胶免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备抗MDV-1VP22C的mAb，并通过ELISA、间接免疫荧光（IFA）、Western blot鉴定其特性。结果：获得了2株可稳定分泌抗MDV-1VP22C的mAb的杂交瘤细胞，命名为3F7、4FA。IFA鉴定表明，两株mAb均能与感染MDV-1的成纤维细胞反应，其中，3F7mAb染色呈现MDV空斑，而4FAmAb呈现整个单层的细胞核荧光。ELISA和Westernblot分析表明，3F7能与杆状病毒表达的VP22反应，4FA不具备该特性。对3F7mAb进一步鉴定，确定了该mAb针对的具体位置在94～193aa处，是蛋白转导域的预测位置。结论：成功地制备了抗MDV-1VP22C的mAb，为深入研究VP22蛋白的转导功能提供了有用的试剂。     

人类微小病毒B19结构蛋白VP2的重组表达及单克隆抗体的制备

目的：制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体（mAb）杂交瘤。方法：采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因，经克隆、测序确认后，再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB／c小鼠，制备可分泌特异性B19 mAb的杂交瘤细胞。以真核表达载体转染CHO细胞后，筛选单细胞表达克隆，将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应。结果：从患者血清标本中扩增出了1665bp长的DNA，测序结果证实为vp2基因。将该基因克隆至原核表达载体中后，在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经SDS-PAGE后，在Mr约为6000处可见1条明显的表达带。Western blot的结果表明，该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应。以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原，免疫BALB／c小鼠，经细胞融合、克降化，获得2株分泌特异性的抗VP2 mAb的杂交瘤细胞。以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应。用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清，也与筛选到的mAb呈阳性反应。结论：成功地制备抗VP2的mAb，为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

抗SARS-CoV重组纤突蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

SARS冠状病毒(SARS-CoV)严重威胁人类的健康,对其深入研究具有重要的现实意义。许多研究表明,SARS-CoV的S糖蛋白(spike glycoprotein)为其主要抗原,在病毒与宿主细胞表面受体结合并介导病毒经膜融合进入细胞中起关键作用。SARS-CoV病毒S蛋白的N末端含有由疏水性氨基酸组成的短的Ⅰ型信号序列,C末端含有跨膜结构域和富含半胱氨酸残基的胞质区尾部。这些序列在SARS-CoV中高度保守[1,2],因此,可以通过检测S蛋白诊断SARS-CoV病毒的早期感染。本研究中,我们制备了抗S蛋白的单克隆抗体(mAb),并对其特性进行了鉴定,为建立诊断SAR…     

抗NPM1单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定NPM1单克隆抗体.方法 利用纯化的NPM1融合蛋白作为抗原,通过常规的细胞融合技术制备杂交瘤细胞,用间接ELISA法筛选能出产生抗NPM1单克隆抗体的阳性细胞株,对抗NPM1单克隆抗体的特性进行分析.结果 筛选出1株产生抗NPM1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,产生的抗体为IgGl亚类,效价达1∶720000;纯化后经SDS-PAGE显示两条蛋白条带,纯度达95％以上,相对分子质量约为50000和25000,与单一抗体重链、轻链分子大小相符.免疫组化证实,纯化的2G7抗NPM1单克隆抗体可检测出NPM1在结直肠癌表达,阳性位点为细胞核.结论 制备的抗NPM1单克隆抗体可用于NPM1蛋白功能的研究与临床检测.     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备有生物学活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以纯品ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠4次。采用杂交瘤技术,经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株。采用动物体内诱生的方法大量制备mAb。以protein G对其进行纯化后,用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig亚类。用Western blot鉴定mAb的特异性。结果:筛选出4株可稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为B9株、F1株、C11株和D6株。4株mAb的Ig亚类均为IgG1。4株mAb培养上清的效价均为1∶1 000;腹水的效价B9株与D6株为1∶2×105,F1株与C11株为1∶4×105。纯化后mAb的蛋白浓度为1.2 g/L,均可与ICAM-1特异性结合。结论:成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM-1 mAb,为进一步研究ICAM-1的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定鼠抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体。方法重组核蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤并进行有限稀释法克隆和亚克隆,建立分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单克隆抗体并进行效价测定和特异性鉴定。结果建立了1株能稳定分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F6E8,重链为IgG2a,轻链为κ。ELISA法测得腹水的效价高达1∶32 000以上。Western-blot和间接免疫荧光实验证实该单克隆抗体能特异性结合重组核蛋白及天然核蛋白。结论成功制备了效价高、特异性好的抗核蛋白单克隆抗体,为建立博尔纳病病毒血清免疫学检测方法奠定了基础。