阴道毛滴虫cDNA文库的构建和鉴定

目的 :构建阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)全长cDNA表达文库 ,筛选全长目的基因 ,研究与其细胞周期相关基因的结构和功能。方法 :从Tv中提取总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库试剂盒构建其全长cDNA表达文库。结果 :所建文库的初始滴度为6 78× 10 6 pfu mL ,经一次扩增后的滴度为 1 6 8× 10 9pfu mL ,重组率 >98%。结论 :成功构建Tv全长cDNA文库 ,并从该文库中筛选出了与细胞周期相关的基因     

云南个旧肺鳞癌YTMLC细胞cDNA文库构建和鉴定

目的构建云南个旧人肺鳞癌YTMLC-90细胞cDNA文库。方法从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dr)引物(含S6 ⅠB酶切位点)合成cDNA第一链,同时根据真核生物mRNA5’端帽子结构特点。利用SMART寡核苷酸(含S6 Ⅰ A酶切位点)作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板,进而以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经S6Ⅰ(ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后,克隆入经S6Ⅰ酶切的载体后经体外包装而成cDNA文库。结果人肺癌细胞YTMLC-90的cDNA文库获得1.01×10~6pfu/ml个重组子,重组率为93.2％,文库扩增后,滴度达5.24×10~6pfu/ml,插入cDNA的长度为750～3000bp。结论所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因奠定了基础。     

华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

目的 构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30％左右,1kb～500bp占69％。结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库。     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定

目的　构建大劣按蚊成蚊cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础。方法　分离大劣按蚊成蚊mRNA ,用Stratagene公司的ZAPExpress文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量。结果　所建文库滴度达 2 1× 10 6pfu/ml,重组效率达 98%以上 ,插入片段长度平均为 1kb以上。结论　采用ZAPExpress文库构建试剂盒可以成功构建出较高质量的大劣按蚊成蚊cDNA文库     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组CDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因。方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%。2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因。13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子。结论　胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解。     

大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析

目的 克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA。方法 以大鼠大脑Marathon Ready cDNA为模板，采用SMART RACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA，产物亚克隆刘pGEM-T easy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析。结果 经过3次5’RACE扩增，得到的5号EST cDNA长度为5663bp，其中包含1个2136bp的完整的开放读码框序列，与已知大鼠基因芳香烃受体核转位因子2（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator2，Arnt2）完全同源：该cDNA 3’瑞非编码区长达3323bp，包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列。结论 5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2，该基因3’端完整的非编码区cDNA序列为首次报道。神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础。     

人IL-12 cDNA的克隆

目的: 克隆人IL-12的cDNA。方法：利用RT-PCR从人NC 37淋巴母细胞中克隆出IL-12中两个亚基p35和p40的cDNA并进行序列测定。结果：从NC 37细胞中克隆的p35 cDNA序列(GenBank登录号为AF 101062)与先前登录在GenBank上的M65271 (NC 37细胞来源）和M 65291(RPMI 8866细胞来源,美国专利号：5648467）的p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同：编码第44位氨基酸残基密码子的第3个碱基M 65291是C,而M 65271和本研究AF 101062的相应序列2是G;编码第244氨基酸残基密码子的第3个碱基,M 65271序列是C,而M 65291和AF 101062的相应序列是T;编码第247氨基酸残基密码子的第2个碱基M 65271序列是C,而M 65291和AF 101062的相应序列是T。此外,本研究克隆的p40 cDNA序列与登录在GenBank的p40 cDNA (M 38444)序列完全相同。结论：尽管本研究克隆的p35 cDNA序列与已知的两种p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同,但其编码的氨基酸序列却与专利登记的p35 cDNA（M 65291）编码的氨基酸序列完全一致,表明克隆的IL-12基因所表达的蛋白质在理论上是符合目前药用标准的。     

亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1（elongation factor 1,EF-1）基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：∥ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能。结果该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162。结论应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因。     

硫酸右旋糖苷对人胃癌MKN1细胞的黏附以及整合素β1表达影响的研究

目的通过观察细胞的黏附过程和整合素β1的cDNA的表达,研究硫酸右旋糖苷(DS) 抑制人胃癌MKN1细胞株的黏附过程的机制.方法用位相差显微镜对MKN1细胞在培养盘上的附着过程及形态变化进行了观察.用半定量RT-PCR法对整合素β1 的cDNA的表达水平进行了测定.结果 DS抑制了MKN1细胞在培养盘上的附着,培养48小时后仍有部分细胞处于游离状态.在DS治疗组,黏附细胞和游离细胞内整合素β1的cDNA的表达水平分别减少到非治疗细胞的74% 和38%.结论 DS对人胃癌细胞株MKN1的黏附过程的抑制与对整合素β1 cDNA表达的抑制有关.     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆与测序

目的探讨通过分子生物学技术克隆人铜锌超氧化物歧化酶的cDNA片段。方法从人正常肝细胞中提取总RNA,然后对其进行反转录产生第1条cDNA链。根据GeneBank中人铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）cDNA序列（序列号AB087266）设计1对PCR引物,对反转录后产生的第1条cDNA链进行PCR扩增,获得目的基因。结果获得459bp预期大小的PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳和测序验证,使用序列分析软件证明,提取的是所需要的hSOD1cDNA的片段。结论获得的目的片段纯度高,未降解,能满足进一步试验的需要。     

大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

从大鼠皮肤提取总RNA, 以P1 5′→3′TTCAGTCATGAGGATCCATTAC和P2 5′→3′ GGTTCTTGGTCTTTTTATCTAC引物,采用RT-PCR技术扩增得到一cDNA片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β-防御素-2和大鼠β-防御素-1进行同源性比较,结果显示,该cDNA片段编码的氨基酸序列具高度同源性(其成熟肽与hBD-2的同一性为50%,相似性为32%),均含6个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的cDNA为大鼠β-防御素-2亚类,因此命名为rBD-2.大鼠β-防御素-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似,能够被诱导表达.以上结果提示,β-防御素-2可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质.     

人脐静脉内皮细胞E-选择素分子克隆

为探讨Ｅ－选择素结构与功能的关系。方法：采用人脐静脉内皮细胞,经分离培养及激活后,提取 总 ＢＮＡ,用 Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶将其转录成 ｃＤＮＡ第一链,设计引物行ＰＣＲ扩增。结果：其产物经电泳测定为 １．９ ｋｂ的 片段,即Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的全长编码区。先将ｃＤＮＡ连接至ＰＵＣ－１８载体并转化至ＪＭ－１０９中,提取质粒ＤＮＡ。再将 Ｅ－选择素酶切为３个片段进行序列测定,显示人脐静脉内皮细胞Ｅ－选择素与文献报道略有差异：即５３位Ｇ→Ａ;６５５ 位Ｔ→Ｃ而导致氨基酸的改变（亮氨酸→脯氨酸）;１９１４－１９１６位缺失ＡＧＣ（丝氨酸）。结论：为进一步研究Ｅ－选择素 结构与功能的关系,制备探针与单克隆抗体打下基础。     

突变型IκBα cDNA的克隆及其表达载体的构建

大量研究显示，慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病以及淋巴细胞性白血病等均具有持续活化的核因子κB（nuclearfactor—κB，NF—κB）。因此，NF—κB的活化可能与白血病发生及其进展密切相关。NF—κB活化后，除了可调节参与细胞生长和增殖相关基因的表达外，还可上调凋亡抗性分子如cIAP1和TRAF1等基因的表达，从而使肿瘤细胞逃避凋亡。相反，抑制NF．κB活性，则能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。因此，研究白血病细胞NF—κB的活化及其调控对揭示白血病的发病机制以及寻找白血病治疗新的靶分子具有重要意义。     

人PPARγ2 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

目的克隆中国人的PPARγ2 cDNA,并在大肠杆菌中进行表达纯化.方法从正常人面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR及序列测定等方法获得人的PPARγ2 cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Western blot分析和用Ni2 -NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析.结果获得了正常中国人的PPARγ2 cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-PPARγ2;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量为56×103的PPARγ2目的蛋白;表达产物经Ni2 -NTA离子交换树脂纯化,PPARγ2蛋白的纯度大于90%以上.结论克隆得到正常中国人PPARγ2 cDNA的序列与Genebank报道的序列一致,并且在E.coli中成功表达和纯化了PPARγ2蛋白.此研究为后续PPARγ2功能活性和配体的筛选实验奠定了基础.     

应用全自动DNA测序仪测定人胰岛素cDNA碱基序列

糖尿病病因复杂 ,虽经多年不懈努力 ,但糖尿病的诊疗仍是一大难题。近年来 ,应用分子生物学技术 ,解决了很多疾病的诊治难题。因此若要彻底解决糖尿病诊治问题 ,应用分子生物学技术也许是一条捷径。在先期的工作中已获得人胰岛素ｃＤＮＡ克隆 ,本实验则对人胰岛素ｃＤＮＡ进行了测序。１材料与方法１．１人胰岛素ｃＤＮＡ克隆的获得由天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫研究室制备 ,方法从略。１．２人胰岛素ｃＤＮＡ序列的测定１．２．１模板的准备１．２．１．１质粒模板ＩＮＳ -１为构建的扩增质粒 ,即 ｐｕｃ１８ +人胰岛素ｃＤＮＡ ;ＩＮＳ …