人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白,从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3N端的多克隆抗体,抗体滴度为1：64000,经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的克隆表达与多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY并制备多克隆抗体。 方法: 通过PCR技术从伤寒沙门菌基因组DNA中获得伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,再将此基因片段克隆到表达载体pET22b(+)上,并转入大肠埃希菌JM109进行表达;Ni柱纯化后的OsmY蛋白作为抗原免疫家兔,并获得多克隆抗体。 结果: 成功制备伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的蛋白表达菌株,并获得了纯化的OsmY蛋白,成功制备兔抗OsmY的多克隆抗体。 结论： 成功克隆表达了伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,并获得了多克隆抗体,有助于今后研究OsmY在伤寒沙门菌高渗应激中的作用。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

致肾盂肾炎大肠埃希菌黏附素表达载体构建及表达产物抗原性检测

目的 构建致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)P菌毛黏附素PapG重组融合蛋白表达载体．检测该重组蛋白的免疫原性。方法 设计并合成一对P菌毛PapG黏附素结构基因的PCR扩增引物；筛选、鉴定重组质粒。以IPTG诱导PapG与GST重组融合蛋白表达．表达产物经亲和层析纯化后用Western blot分析。结果 成功地构建papG结构基因重组表达载体．所表达的重组蛋白相对分子质量约63kD．可为UPECP菌毛多克隆抗体所识别。结论 所获得的PapG-GST重组融合蛋白纯化产物保持了天然抗原性．可用于疫苗研制及其他免疫学研究。     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并纯化制备相应的多克隆抗体.方法: 利用PCR 技术从H:z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66,将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体.结果: 经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66 被成功导入表达载体pET-28a(+),并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体.结论: 成功克隆表达了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并制备了相应的多克隆抗体,为今后深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础.     

甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法 将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB 培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达, 表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果 克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46 000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签（氨基端）和HA标签（羧基端）。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论 成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建胱抑素C（cystatin C,Cys-C）原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a（＋）-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside,IPTG）诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank（NM-000099.2）中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20000,经Ni2＋-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的：获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法：人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b（＋）中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果：Tα1②Mr约为6.3×10^3,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论：成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.     

固醇调控核因子bHLH-Zip的原核表达及其抗血清的制备

[目的]制备固醇调控核因子bHLH-Zip片段及其多克隆抗血清,为细胞固醇代谢及调脂药物研究提供材料。[方法]将人源固醇调节元件结合蛋白SREBP的N端第323-553位氨基酸残基的基因序列即bHLH-Zip片段克隆到表达载体pcDNA4/hismaxA,得到重组质粒pHis-bHLH-Zip,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达;裂解细菌并纯化目的蛋白;用纯化后的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定效价。[结果]获得纯化bHLH-Zip片段,并制备其多克隆抗血清。抗bHLH-Zip抗血清的效价为1:16000。[结论]bHLH-Zip核因子是一段可溶性蛋白,并可制备产生具有较高效价的多克隆抗血清,这为研究细胞固醇代谢及调脂药物对SREBP通路的影响奠定了基础。     

甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测

目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。