重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

^99Tc^m-亚锡葡庚糖酸钠结合GGC序列监测基因治疗的实验研究

目的 构建以金属结合肽（双甘氨酰半胱氨酸,即GGC序列）为核素报告基因、人VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体,以99Tcm-GH为报告探针,探讨该报告系统监测治疗基因表达的可行性.方法 pcDNA3-VEGF165质粒线性化后,将金属结合肽GGC序列连于VEGF165基因C端,通过内部核糖体切入位点（IRES）连接增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,构建重组腺病毒载体Ad5-VEGF165GGCmotif-IRES-EGFP（Ad5-VIE）,同时构建腺病毒包装EGFP（Ad5-EGFP）为对照.以不同感染复数（MOI=0,10,25,50,100）Ad5-VIE感染大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）后,用99Tcm-GH为报告探针,研究感染细胞摄取动力学（30,60,90和120 min）情况,以检测GGC序列在MSC中的表达,并与实时定量PCR、Western-blot蛋白印迹、免疫组织化学等方法鉴定的VEGF165表达进行对比分析.通过荧光显微镜及实时定量PCR检测EGFP在细胞中的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,组间比较运用独立样本成组t检验、q检验和直线（Pearson）相关分析.结果 以Ad5-VIE感染MSC后,不同MOI摄取实验结果示细胞对99Tcm-GH的摄取率随病毒MOI的增加而逐渐增加（r2=0.86,P＜0.05）,并且在MOI=100时达到（7.94±0.75）%;不同时间摄取实验示随99Tcm-GH孵育时间延长,细胞摄取率逐步增高,至120 min时达到（7.72±0.22）%.Ad5-VIE感染组与Ad5-EGFP感染组摄取率在各个不同时间点差异均有统计学意义（t=15.10～54.92,P均＜0.05）.在mRNA水平上,VEGF165及EGFP表达均随病毒MOI增加而增加（r2=0.99,P＜0.05）.不同MOI下细胞对99Tcm-GH的摄取与VEGF165蛋白表达呈较好的相关性（r2=0.90,P＜0.05）.免疫组织化学检查结果表明人VEGF165目的 基因在MSC中成功表达.荧光显微镜下可以观测到被感染细胞中的EGFP蛋白.结论 成功构建的重组腺病毒系统Ad5-VIE感染MSC对99Tcm-GH的摄取与VEGF165表达呈正相关.以GGC多肽为报告基因可以监测治疗基因VEGF165的表达,为核素报告基因显像提供了理论依据.     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

红色荧光-VEGF165融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF165(hVEGF165)红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体。方法 根据已知的人VEGF165序列,用PCR方法,从质粒pUC18／VEGF165中扩增出去除终止密码子的VEGF165片段,定向克隆至pDsRed1-N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导,将pDsVEGF165Red1-N1转染293-T细胞,48小时后用RT-PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF165在细胞内表达和分布情况。结果 重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确,并在293-T细胞中表达。报告基因-红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论 成功构建了pDsVEGF165Red1-N1红色荧光蛋白融合表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中表达,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具。     

含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒的构建及体外表达

目的构建含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒,并使之转染人BJ细胞,测定其转染效率及目的蛋白表达情况。方法PCR目的基因序列,克隆成穿梭载体后转化大肠杆菌,扩增提取质粒,鉴定正确后与骨架载体重组,鉴定重组质粒正确并无野毒后在293细胞中扩增,CsCl密度梯度离心法纯化腺病毒。按不同梯度MOI值感染成纤维细胞,根据绿色荧光强度检测其转染效率。1周后用免疫组化方法检测目的蛋白HO-1表达情况。结果对重组腺病毒进行酶切和PCR鉴定,证实含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒构建成功,纯化后病毒滴度达到1.0×1010pfu/ml。通过免疫组化检测可在成纤维细胞中观察到胞浆内有棕褐色目的蛋白阳性颗粒表达。结论可以成功构建含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒并表达目的蛋白。     

负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

携带人血红素氧合酶-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建人血红素氧合酶 - 1(hHO - 1)重组腺病毒,为基因治疗心肌细胞缺氧性损伤提供可能.方法:将hHO - 1 cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV,得到重组质粒pSGCMV - hHO - 1.采用位点特异性重组系统(Cre/Loxp)将pSGCMV - hHO - 1与腺病毒骨架载体pBHGloxP△E3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,生成带有hHO - 1基因的重组腺病毒载体Ad - hHO - 1.重组腺病毒质粒在293细胞中扩增,氯化铯梯度离心纯化.结果:经酶切鉴定和测序证实载体构建的正确性,病毒滴度为2.0×1010pfu/ml.结论:成功构建带有hHO - 1 cDNA的重组腺病毒,可用于对心肌细胞缺氧性损伤的基因治疗研究.     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人miR-29a前体全长cDNA（pre-miR-29a）的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-miR29a）。方法将pre-miR-29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE13、Cre共转染人胚肾293细胞（HEK293）,包装重组慢病毒Ad-miR29a,扩增、收集并纯化。对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定、感染性鉴定及PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×109 pfu/ml。PCR鉴定Ad-miR29a可扩增出pre-miR-29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre-miR-29a特异片段。Ad-miR29a感染人胃癌SGC-7901细胞后,可明显提高miR-29a的表达丰度。结论成功包装了负载miR-29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。     

131^I-FIAU在不同载体介导的HSV1-tk转导心肌细胞中的实验研究

目的为以单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（HSV1-tk）为报告基因的核素心脏显像寻找合适的载体并提供依据。方法以胶原酶单次消化法获得乳鼠原代心肌细胞，分别应用重组腺病毒Ad5-HSV1-tk（Ad5-tk）和脂质体lipofectamine^TM2000包裹的重组质粒pDC316-tk（pDC316-tk／lipoplex）将报告基因HSV1-tk转导入细胞，以空载体腺病毒作为对照；采用Iodogen固相氧化法对特异性报告探针氟-碘阿糖呋喃基脲嘧啶（FIAU）进行131^I标记，经Sep-Pak C18反相色谱层析柱纯化后，测定标记物的标记率和放化纯；比较各组细胞对131^I-FIAU的摄取情况，并应用半定量反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫细胞化学方法，在mRNA和蛋白质水平检测不同载体介导HSV1-tk转导心肌细胞后HSV1-tk的表达。结果131^I-FIAU的标记率为（53．82±2．05）％，放化纯为（94．85±1．76）％，标记物在体外稳定存在；转导后5h，Ad5-tk感染组和pDC316-tk／lipoplex转染组对131^I-FIAU的摄取率分别为（12．55±0．37）％、（2．09±0．34）％，且各时间点摄取率前者均明显高于后者（t=12．978～38．253，P均〈0．01）；2种载体介导心肌细胞转导后24h，RT—PCR即可检测到HSV1-tk mRNA的表达，且Ad5-tk感染组的表达水平明显高于pDC316-tk／lipoplex转染组（3．11±0．14与1．60±0．05，t=17．663，P〈0．01）；免疫细胞化学检测中二者阳性率分别为（81．70±0．40）％、（22．06±0．32）％，差异有统计学意义（t=23．237，P〈0．01）。结论腺病毒载体介导HSV1-tk感染心肌细胞的效率和对标记探针的摄取率均明显高于脂质体介导组，其可做为活体报告基因心脏显像的载体，可得到更为清晰的显像图。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

重组人survivin腺病毒的构建与鉴定

目的构建人survivin基因shRNA重组腺病毒载体,为缺氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension, HPH）的基因治疗研究提供实验基础。方法构建survivin-siRNA表达质粒,测序鉴定正确后,将survivin-siRNA表达质粒与含有腺病毒右臂的骨架质粒pBHGE3共转染至人293A细胞,包装成腺病毒Ad-survivin并扩增,TCID50法测定病毒滴度。将人肺动脉平滑肌细胞缺氧培养24 h,并将细胞分为空白对照组（Con组）,阴性对照组（Ad-LacZ组）,不同Ad-survivin序列的干扰组（sh1组、sh2组、sh3组）。Ad-survivin感染缺氧人肺动脉平滑肌细胞,Western blot检测survivin蛋白,验证重组腺病毒干扰效果。结果①将shRNA片段与pAd-U6-CMV连接后的质粒进行测序,结果提示目的基因片段插入成功;②TCID50法测定病毒Ad-survivin-shRNA1、Ad-survivin-shRNA2和Ad-survivin-shRNA3的滴度分别是1×1010,1.2×1010,1×1010;③sh2组缺氧人肺动脉平滑肌细胞内survivin蛋白表达明显低于其他4组(P＜0.05)。结论本研究成功构建人survivin腺病毒载体,为研究survivin基因在缺氧性肺动脉高压中的作用提供了实验基础。     

人CD40L胞外区和人CTLA4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的：构建人CD40L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法：RT-PCR扩增人CD40L胞外区片段，与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒，经酶切、插入、同源重组，获质粒pAdshCD40L-IRES2-CTLA4Ig，经293细胞包装，获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40L-IRES2-CTLAg，并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果：电泳、PCR扩增出了600bp和400bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论：成功构建了人CD40L．胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

血管内皮细胞生长因子基因转染皮肤成纤维细胞的实验研究

为改善人工复合皮在临床上的应用效果 ,构建人血管内皮细胞生长因子 16 5 (hVEGF165)基因重组载体pcDNA3,并转染成纤维细胞。检测转基因细胞培养上清液VEGF浓度 ;用转基因细胞培养上清液刺激人脐静脉血管内皮细胞 ,观察内皮细胞增殖速度 ;通过Miles实验检测VEGF的生物学活性。结果显示 ,转基因成纤维细胞能够表达一定浓度的VEGF,且具有加速体外培养人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)生长和增强血管通透性的生物学活性。提示转hVEGF165基因成纤维细胞可修饰人工皮的真皮面。