超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

基因转染技术的高速发展不仅革新了生物学和医学许多基本问题的研究,也推动了诊断和治疗的进步。基因作为核酸类生物活性大分子,极易在体内降解,因此传递基因的载体尤为重要。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术利用超声波和微泡之间的相互作用,以及其产生的生物学效应,使微泡携基因进行转染,并与多种载体联合应用,为疾病的治疗提供了有效手段。本文就UTMD技术介导基因转染的研究进展进行综述。     

超声联合微泡造影剂促进干细胞移植研究进展

干细胞移植已应用于多种疾病的治疗研究,但其效果受到移植干细胞存活率、分化率以及靶向性等因素影响.随着超声影像学技术的不断发展,超声联合微泡造影剂不仅能有效介导细胞基因转染,而且能靶向性传递移植细胞,从而提高干细胞移植效果.本文将就近年来超声联合微泡造影剂促进干细胞移植的研究进展作一综述.     

靶向超声微泡造影剂与超声分子显像

超声分子显像是一门新兴发展的，以靶向超声微泡造影剂为显像剂，能够对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与显像的方法。本文对靶向超声微泡造影剂与超声分子显像的研究现状及发展方向进行了综述。     

超声波与微泡声学造影剂增强基因定位转染动物实验研究

目的观察经静脉注射基因与微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏方式能否增强小鼠肝脏基因定位转染及其转染效率.方法昆明种小白鼠24只,随机分为4组,每组6只.第1组为单纯质粒转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg乙型肝炎核心抗原(pcDNA3.1/HBV)质粒的生理盐水溶液.第2组为单纯微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂.第3组为单纯超声转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的生理盐水溶液,同时采用频率为1 MHz、声强为0.5 W/cm2的超声波经小白鼠体表肝区辐照1 min.第4组为超声与微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂,同时经小白鼠体表肝区局部采用相同剂量超声辐照1 min.7天后处死小鼠,分别取肝、肾、肺、心、脾、骨骼肌组织进行pcDNA3.1/HBV免疫组化检测,记录不同组织每高倍视野(×400)pcDNA3.1/HBV表达阳性细胞数.结果第1、2组肝、肾组织内偶见pcDNA3.1/HBV表达弱阳性细胞,肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达阳性细胞.第3组肝组织内可见少量pcDNA3.1/HBV阳性细胞,每高倍视野表达阳性细胞(26.5±3.9)个.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.第4组肝组织内pcDNA3.1/HBV表达最强,每高倍视野表达阳性细胞(84.2±4.4)个,为第3组的约3.2倍.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.结论静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,能显著增强辐照部位局部组织的基因转染与表达,有望成为一种安全、高效的体内基因定位转染新技术.     

超声联合阳离子微泡造影剂体外增强基因转染

目的探讨超声介导自制阳离子微泡破坏、增强基因转染的效果,并与普通脂质微泡对比,寻找一种更可靠、完善的基因载体工具。方法采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备阳离子微泡,观察其物理特性并检测其体外载基因能力。将微泡和质粒DNA加入人脐静脉血管内皮细胞后分为6组,观测不同微泡浓度对细胞存活率的影响,应用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率。结果自制阳离子微泡形态规整、分散度好,最大载基因率为39.7%。超声联合阳离子微泡能够增强基因转染,与普通脂质微泡组相比差异有统计学意义;随着微泡浓度增加,细胞损伤增大。结论采用自制阳离子微泡可在体外实现较高效率的基因转染。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

载自杀基因的靶向微泡联合超声抑制视网膜母细胞瘤的实验研究

目的 探讨载自杀基因的靶向微泡联合超声对视网膜母细胞瘤（RB）的抑制作用。方法 制备携带单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）质粒和VEGFR2抗体的靶向微泡,分为空白对照组、细胞+质粒组、细胞+质粒+SonoVue组、细胞+靶向微泡组、细胞+质粒+超声辐照组、细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组和细胞+靶向微泡+超声辐照组进行实验。荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测转染率,加入丙氧鸟苷（GCV）后,检测细胞的抑制率。结果 细胞+靶向微泡+超声辐照组的转染率为（24.78±1.04）%,较细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组（14.31±0.69）%高。随着GCV浓度的增加,培养时间的延长,各组的抑制率逐渐升高。当GCV浓度在100 mg/l,培养96h后,细胞+靶向微泡+超声辐照组对RB细胞的抑制率达（92.91±1.71）%。结论 在加入GCV后,携带HSV1–tk的靶向微泡联合超声能有效的抑制RB细胞。     

微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨微泡造影剂SonoVue联合超声辐照在介导体内基因转染中的作用。方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒（pEGFP），添加或不添加SonoVue，脉冲多普勒超声辐照（1MHz，2W／cm^2）瘤组织。持续时间1、5、10min，7d后流式细胞仪、荧光显微镜评价pEGFP转染率。HE染色行肿瘤病理学检查。结果SonoVue联合超声辐照组pEGFP的转染率显著高于单纯超声辐照组（P〈0．01）；仅SonoVue与单纯pEGFP2组间转染率无显著差异（P〉0．05）；辐照时间5、10min时pEGFP表达明显高于1min（P〈0．05）。5与10min组间pEGFP表达无显著差异（P〉0．05）。HE染色肿瘤组织无坏死灶出现。结论微泡造影剂联合超声辐照可明显提高基因转染率，且对组织无损害。     

超声靶向微泡造影剂及其主要研究进展

自20世纪60年代Dr Joiner通过左心导管注射靛青绿后发现超声回声信号增强,1968年美国Rochester大学Gramiak等[1]首次将自制的微泡(microbubble)进行超声心动图检查以来,超声微泡造影剂的研究得到了很大发展,尤其     

超声微泡造影剂声诺维与基因转染的研究

超声微泡是一种新型基因转染的载体,超声辐照微泡（SonoVue）可增加基因在体内及体外的转染效率。若在不损伤基因和组织的前提下促进基因的转染,合适的辐照条件是非常重要的。     

靶向超声造影剂促进反义基因转染的体外研究

目的 探讨超声破坏造影剂微泡联合半乳糖化多聚赖氨酸(G-PLL)对基因治疗肝癌的靶向促进作用.方法 将合成的超声造影剂微泡、G-PLL及c-myc反义寡核苷酸(ASODN)耦联物,结合超声辐照作用于表达c-myc基因的人肝癌及人肺癌细胞株进行体外效应研究.观察细胞形态学改变及耦合物与细胞结合情况并检测c-myc基因的表达情况.结果 镜下显示肝癌细胞较肺癌细胞更易于与耦联物结合,多数细胞呈凋亡改变.经超声辐照,耦联物作用后的人肝癌及肺癌细胞c-myc基因表达量均有降低,而G-PLL对肝癌细胞c-myc基因表达有明显抑制作用.结论 超声辐照下,造影剂结合G-PLL及反义基因耦联物可靶向性促进反义基因转染肝癌细胞.     

靶向微泡造影剂介导c-myc反义基因治疗移植肝癌的实验研究

目的研究携半乳糖化多聚赖氨酸(G-PLL)的靶向超声造影剂介导c-myc反义寡核苷酸(c-myc ASODN)在肝癌组织中的转染效果。方法以"生物素-亲和素"系统制备超声微泡、G-PLL和c-myc ASODN三者的耦联物,静脉导入荷瘤鼠体内,给予超声辐照。定期测量肿瘤大小,计算抑瘤率,绘制肿瘤生长曲线。28d后处死小鼠,取肿瘤组织检测c-myc基因和蛋白的表达情况。结果耦联物作用后的实验组抑瘤率明显高于其它各组,肿瘤生长受到明显抑制(P0.05);肿瘤内c-mycmRNA及cmyc蛋白的表达也均低于其它各组(P0.05)。结论耦联G-PLL及反义基因的微泡造影剂经超声辐照可提高治疗基因在小鼠肝癌组织中的转染率。     

Ultrasound with Microbubble Contrast Agent and Urokinase for Thrombosis

This study was aimed at assessing the effects of urokinase (UK) in combination with ultrasound and microbubbles in in vitro and in vivo thrombolytic therapy for the treatment of deep vein thrombosis (DVT). Thrombi with formation times of 1, 3, 7, 14 and 21 d were used for thrombolysis. Forty-five adult mongrel dogs were used to evaluate thrombosis in vivo. Both in vitro and in vivo analyses revealed that UK?+?microbubbles had the best effect among the combinations. Thrombolysis <7 d was more effective at a thrombolysis rate of about 50%, but the thrombolytic effect of thrombi >7 d was poor at thrombolysis rates <30%. Ultrasound?+?UK significantly increased the thrombolysis rate of thrombi <7 d. These results suggest that the combination of ultrasound with microbubble contrast agents and UK may have a synergistic effect on thrombolysis.     

A Review of Phospholipid Encapsulated Ultrasound Contrast Agent Microbubble Physics

Ultrasound contrast agent microbubbles have expanded the utility of biomedical ultrasound from anatomic imaging to the assessment of microvascular blood flow characteristics and ultrasound-assisted therapeutic applications. Central to their effectiveness in these applications is their resonant and non-linear oscillation behaviour. This article reviews the salient physics of an oscillating microbubble in an ultrasound field, with particular emphasis on phospholipid-coated agents. Both the theoretical underpinnings of bubble vibration and the experimental evidence of non-linear encapsulated bubble dynamics and scattering are discussed and placed within the context of current and emerging applications.     

JAR细胞靶向微泡造影剂的体外研究

目的探讨体外靶向SonoVue微泡与人绒毛膜癌细胞（JAR细胞）的结合特性、结合率及靶向微泡的稳定性,为在体研究肿瘤细胞抗原的超声定位显像奠定基础。 方法用SonoVue微泡与兔抗人HCG抗体作用制成靶向造影剂、然后分别与JAR细胞及子宫内膜间质细胞（ESC）作用,比较各自的结合率及冲洗前后的结合率。 结果SonoVue微泡与兔抗人HCG抗体的结合率为67.6%;JAR细胞与靶向SonoVue微泡的花环形成率为（84.3±5.5）%,明显高于ESC的花环形成率（11.4±1.5）%（P〈0.05）;靶向SonoVue微泡与贴壁生长的JAR细胞结合率为（85.8±3.3）%,冲洗后结合率为（82.4±3.7）%（P〉0.05）;流式细胞仪检测JAR细胞与靶向SonoVue微泡的结合率为81.0%。 结论在体外靶向SonoVue微泡与JAR细胞特异性结合力具有一定的强度,可望实现靶向显影。     

声诺维联合超声辐照增强绿色荧光蛋白质粒转染血管内皮细胞的实验研究

目的探讨造影剂声诺维(SonoVue)联合超声辐照人脐血管内皮细胞(HUVEC)时增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP)的瞬时转染效率。方法使用连续多普勒超声辐照方式介导pEGFP转染HUVEC,照射条件为频率1.9MHz,TIS0.8,SATA为80.0mW/cm2,时间持续5min,添加或不添加2%SonoVue,pEGFP浓度为50μg/ml。48h后用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染表达率,并用台盼蓝染色检测细胞活性(生存率)。结果单纯超声辐照组GFP转染率仅为1.5%±0.2%,SonoVue联合超声辐照组为16.1%±1.9%(P<0.001);两组细胞生存率分别为94.1%±2.3%和91.1%±4.1%(P>0.05)。结论SonoVue联合超声辐照条件可增强pEGFP转染HUVEC的效率,而对细胞活性无明显影响,此方法可用于目的基因转染。     

含氟烷人血白蛋白靶向超声造影剂的制备研究

目的为靶向超声造影剂的制备进行基础实验研究。方法将含氟烷人血白蛋白超声造影剂与ICAM-1抗体混合,加入0.1%戊二醛,4℃孵育2h,促使抗体与微泡外壳充分交联。普通光镜评估靶向微泡的大小、形态。免疫荧光法进行靶向微泡的鉴定。结果普通光镜下可见携ICAM-1抗体的靶向微泡大小、形态与普通白蛋白微泡对照无明显改变。荧光显微镜证实微泡与ICAM-1抗体整合成功。结论戊二醛交联法适用于白蛋白靶向超声造影剂的制备,方法简便,成本低,重复性好。     

Contrast Agent Microbubble Jetting during Initial Interaction with 200-kHz Focused Ultrasound

The initial response of microbubbles flowing through a 500-μm polycarbonate capillary to a burst of 200-kHz focused ultrasound, at peak-negative pressure amplitudes from 0.7–1.5 MPa, was investigated with dual-perspective high-speed imaging. Directed jetting through the acoustic focus is demonstrated according to the pressure gradients acting across the cavitating microbubbles. At lower amplitudes, repeated microbubble-jetting is accompanied by sudden, intermittent translation. At higher amplitudes a rebound jet also forms, before disintegration into a cavitation cloud.     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

超声微泡促进TDL复合物介导基因转染的体外实验

目的 研究超声微泡促进TDL复合物介导的肝细胞生长因子(HGF)基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的转染效果.方法 将HUVEC接种在24孔板中,随机分为以下5组:(1) 空白对照组;(2) TDL复合物组;(3) TDL复合物 微泡组;(4) TDL复合物 超声组;(5) TDL复合物 微泡 超声组.荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率.MTT法检测该方法对HUVEC生长活性的影响.RT-PCR及Western Blot检测HGF的mRNA及蛋白的表达.结果 TDL复合物 超声 微泡组的绿色荧光强度及转染率均高于其它各组,并对细胞活性无明显影响.TDL复合物 超声 微泡组的HGF mRNA及HGF蛋白的表达也均高于各组.结论 超声微泡可提高TDL复合物介导的基因在体外培养HUVEC的转染效率,并对细胞活性无明显影响,该方法为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略,可能成为缺血性心脏病基因治疗的有效手段之一.