双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化

背景:碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化,并被认为是胶质细胞的分裂原。目的:以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况,及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成。材料:选用50只SD大鼠,按随机数字表法分为4组:假手术组(n=10),脑缺血/再灌注损伤模型组(n=10),骨髓间充质干细胞治疗组(n=15),碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组(n=15)。方法:除假手术组外,其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内,脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。主要观察指标:应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况,比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。结果:移植7d后,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组(P<0.05),两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义(P>0.05)。再灌注7d后,静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积,碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。结论:碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活,并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞,发挥神经修复作用。     

静脉注射途径移植骨髓基质细胞的特点

目的:探讨在大鼠脑缺血的情况下经尾静脉注射移植骨髓基质细胞的可行性,为骨髓基质细胞脑移植治疗提供一种简捷、安全、有效的途径。方法:实验于2005-10/2006-08在北华大学医学院实验中心完成。取1～2个月龄SD大鼠双侧股骨和胫骨,体外分离培养大鼠骨髓基质细胞。取体质量为280～320g的SD大鼠25只,采用颈内动脉线栓法制作大脑中动脉梗死模型,造模成功后在25只大鼠中随机盲抓分为2组:骨髓基质细胞移植组(n=15)、对照组(n=10)。骨髓基质细胞移植组经静脉缓慢推入含Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞细胞悬液1mL(2.0×107个细胞),对照组用同样方法经尾静脉注入等量不含骨髓基质细胞的DMEM培养液作为对照。分别于移植后1d、7d、14d时间点对两组大鼠进行神经功能损害严重程度评分及大脑组织切片观察比较。结果:25只大鼠均进入结果分析。①各代细胞90%以上表达巢蛋白阳性。②与对照组相比,骨髓基质细胞移植组大鼠运动、神经功能恢复明显[骨髓基质细胞移植组:(6.10±2.96),(3.30±1.83),(2.10±1.20)分;对照组:(7.43±1.51),(6.14±1.35),(4.43±1.40)分,P<0.05]。③骨髓基质细胞移植组大鼠脑组织结构较清晰、完整;对照组大鼠脑组织破坏溶解,组织结构松散,细胞结构不完整,胞浆疏松,染色变浅,间质水肿。结论:通过静脉注射进行骨髓基质细胞移植,方法简便、安全,对神经损伤动物组织重建及神经功能有确切的修复效果。     

右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞★

背景:既往研究证实补肾益精中药能体外诱导骨髓基质细胞转化为神经元样细胞。目的:观察右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化作用。方法:密度梯度离心法结合贴壁培养法培养大鼠骨髓基质细胞,将传3代的骨髓基质细胞用右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导向神经元样细胞分化,并设单独碱性成纤维细胞生长因子组和正常组为对照。结果与结论:诱导7d后,光学显微镜下观察右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导组部分细胞呈双极或多极神经元形态。免疫组织化学染色结果显示,与正常组和单独碱性成纤维细胞生长因子组相比,右归丸+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中神经元特异性醇化酶、巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显增高(P<0.05)。结果说明,右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子可体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子对脑出血大鼠神经细胞凋亡的作用

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑出血后神经细胞凋亡的影响。方法:实验于2006-01/07在广西医科大学生理学实验室完成。取成年清洁级Wistar大鼠54只,雌雄各半,体质量250g左右。采用脑内注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,动物于苏醒后按Bederson法进行神经病学评分,评分大于3分后入选本实验,入选54只大鼠随机抽签法分为模型组、生理盐水对照组和碱性成纤维细胞生长因子治疗组,每组又分为1,3,7d三个时间点,每组每时间点6只动物,碱性成纤维细胞生长因子治疗组按8μg/kg剂量肌肉注射,1次/d;生理盐水对照组肌肉注射与碱性成纤维细胞生长因子治疗组相同剂量的生理盐水,1次/d;模型组不作任何干预。各组分别于相应时间点取脑组织,然后应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法测定大鼠大脑皮层、海马神经细胞凋亡数目。结果:纳入大鼠54只,均进入结果分析。在建立脑出血模型中共3只死亡,随后对死亡动物进行解剖,发现脑内血肿量过大,致脑疝形成而导致动物死亡,后随机补充动物。①3d时碱性成纤维细胞生长因子治疗组的皮层神经细胞凋亡数比生理盐水对照组少[(38.33±2.94),(45.33±5.35)个,P<0.05]。②7d时碱性成纤维细胞生长因子治疗组的皮层神经细胞凋亡数比生理盐水对照组少[(29.00±5.48),(43.33±8.62)个,P<0.01]。③7d时碱性成纤维细胞生长因子治疗组的海马神经细胞凋亡数比生理盐水对照组少[(19.83±6.85),(28.33±5.72)个,P<0.05]。结论:碱性成纤维细胞生长因子可抑制脑出血后神经细胞凋亡,减少大鼠脑出血后神经细胞的凋亡。     

双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化术

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006—03在中南大学实验动物中心实验室完成。材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血，再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。结果：移植7d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P〈0．05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P〉0．05）。再灌注7d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑细胞内游离钙变化的影响

背景:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的神经元存活及突起生长,拮抗兴奋性氨基酸毒性,对中枢神经系统功能恢复起重要作用,能否通过影响脑细胞内游离钙离子浓度对缺血脑组织起保护作用.目的:从细胞水平探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时神经细胞内游离Ca2+浓度变化的影响.设计:完全随机对照实验.单位:郑州大学第二附属医院神经内科.材料:实验于2003-08/12在郑州大学第二附属医院神经内科实验室完成.24只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和碱性成纤维细胞生长因子治疗组,每组8只.方法:缺血再灌注组及碱性成纤维细胞生长因子治疗组采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型;假手术组除不插线外,余同其他两组.碱性成纤维细胞生长因子治疗组于缺血后即刻腹腔注射10μg/kg碱性成纤维细胞生长因子,其余两组腹腔注射等量生理盐水.各组大鼠于缺血再灌注24 h检测脑细胞游离钙浓度.主要观察指标:各组大鼠缺血再灌注24 h脑细胞游离钙浓度.结果:24只大鼠全部进入结果分析.缺血再灌注组明显高于假手术组[(673.46±18.44),(224.71±10.58)nmol/L,(F=1 329.06,P＜0.01)],碱性成纤维细胞生长因子治疗组明显低于缺血再灌注组[(378.37±21.08),(673.46±18.44)nmol/L(F=1 329.06,P＜0.01)].结论:碱性成纤维细胞生长因子能明显抑制大鼠缺血再灌注后脑组织内游离钙水平,起到稳定细胞膜,防止细胞内钙超载的作用.     

静脉注射骨髓基质细胞后局灶性脑缺血大鼠胶质细胞源性神经营养因子的表达

背景:骨髓基质细胞移植对局灶性脑缺血的治疗作用,一个更为合理的解释是进入脑内的骨髓基质细胞与宿主大脑相互作用导致其自分泌或旁分泌大量的神经营养因子,这些因子可能有助于损伤神经功能的恢复.目的:观察局灶性脑缺血大鼠静脉移植骨髓基质细胞后胶质细胞源性神经营养因子的表达.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2003-10/2004-09在中国医科大学完成.材料:清洁级健康2月龄Wistar大鼠45只,随机分为细胞移植组、盐水对照组、空白对照组,15只/组.另取Wistar大鼠1只用于骨髓基质细胞的分离培养.方法:贴壁 胰酶消化法分离培养大鼠骨髓基质细胞,取传至第8代前的细胞用于移植,接种前1d进行BrdU标记,制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×109L-1.各组大鼠均采用改良Longa线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,造模后24h,细胞移植组每只大鼠股静脉注射骨髓基质细胞悬液1mL,盐水对照组同法注射等量生理盐水,空白对照组不做任何处理.主要观察指标:分别在造模后3,7,14d,对各组大鼠进行神经功能损伤评分,分值越高代表损伤程度越重.采用免疫组化法检测梗死区胶质细胞源性神经营养因子及BrdU阳性细胞的表达.结果:[1]造模后各时间点,细胞移植组神经功能损伤评分均低于盐水对照组、空白对照组,至造模后14d差异有显著性意义(P＜0.05).[2]造模后各时间点,细胞移植组梗死区胶质细胞源性神经营养因子水平均明显强于盐水对照组、空白对照组(P＜0.05).在梗死半球可见大量BrdU阳性细胞,对侧半球BrdU阳性细胞数量较少.结论:骨髓基质细胞静脉移植治疗局灶性脑缺血,可能与其促进胶质细胞源性神经营养因子大量分泌密切相关.     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:干细胞治疗神经组织损伤的关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,重建中枢神经系统的结构和功能.目的:立体定向移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制.方法:密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10 mg/L的BrdU进行标记.将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹闭法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为对照组、生理盐水组与移植组.移植组大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到脊髓损伤中心,生理盐水组给予等量生理盐水,对照组大鼠不做处理.于大鼠脊髓损伤前及损伤后第7,14,30,60,90天进行BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白、Brdu+碱性成纤维细胞生长因子、Brdu+脑源性神经生长因子免疫组织化学双染阳性细胞及单染阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P＜0.05):生理盐水组BBB评分在损伤后30 d内恢复速度慢于对照组(P＜0.05),至第90天与对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).②移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及免疫组织化学双染阳性细胞.移植组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子单染阳性细胞数明显高于对照组和生理盐水组(P＜0.05).结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关.     

骨髓基质细胞静脉移植对局灶性缺血再灌注损伤脑组织转化生长因子β1的影响

背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法 胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.     

自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病中细胞因子的作用

目的:评估自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病中几种细胞因子的作用。方法:实验于2006-09/12在河北医科大学唐山临床学院中心实验室完成。实验材料:日本大耳白兔40只,清洁级,5月龄,体质量2.5～3.0kg,由华北煤炭医学院动物中心提供(合格证为SCXK-2005-0002),采用完全随机设计方法将日本大耳白兔分为4组:对照组、缺血组、磷酸盐缓冲液组、骨髓单个核细胞治疗组,10只/组。实验方法:对照组不作任何干预措施,其他3组建立日本大耳白兔右下肢缺血模型。取右下肢缺血模型制备2周后的兔,分离获取骨髓单个核细胞。缺血组制备右下肢缺血模型后不作其他干预措施。磷酸盐缓冲液组模型制备2周后,用1mL注射器将0.01mol/L磷酸盐缓冲液分15点注射于右下肢股骨中点股内收肌群内。骨髓单个核细胞治疗组模型制备2周后,用1mL注射器将1×109L-1骨髓单个核细胞悬液分15点注射于右下肢股内收肌群内。实验评估:造模后3d切取内收肌组织标本,测量其组织匀浆中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素1β的含量;4周后行数字减影血管造影术,术后取右下肢内收肌标本,采用CD34免疫组织化学法检测毛细血管密度,观察下肢血管再生情况。结果:40只日本大耳白兔均进入结果分析。①移植后4周腹主动脉造影检测:骨髓单个核细胞治疗组结扎股动脉处的远端毛细血管生成较明显,血管成网状。缺血组及磷酸盐缓冲液组结扎处远端毛细血管生成不明显。②CD34免疫组织化学方法检测毛细血管密度:对照组平均为16个/×400高倍镜,缺血组和磷酸盐缓冲液组平均为5个/×400高倍镜,治疗组毛平均为20.5个/×400高倍镜。骨髓单个核细胞治疗组肌肉标本毛细血管密度明显高于缺血组和磷酸盐缓冲液组(P<0.05)。③造模后3d检测细胞因子含量:缺血组、磷酸盐缓冲液组、骨髓单个核细胞治疗组的碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于对照组[(1.83±0.90),(3.22±2.10),(3.20±1.56),(3.75±1.07)ng/g,P<0.05]。骨髓单个核细胞治疗组白细胞介素1β含量明显高于对照组、缺血组、磷酸盐缓冲液组[(10.87±6.42),(10.74±6.32),(11.80±4.50),(16.73±4.21)ng/g,P<0.05],各组血管内皮生长因子水平差异不明显(P>0.05)。结论:自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性疾病过程中,白细胞介素1β对毛细血管的生成起主要作用。