原位末端标记—TUNEL法检测脊髓凋亡细胞

原位ＤＮＡ末端标记ＴＵＮＥＬ法是目前检测细胞凋亡的一种常用方法 .其基本原理是利用细胞凋亡过程中ＤＮＡ断裂暴露的末端 ,用已标记荧光的碱基与之互补连接 ,而后直接用荧光显微镜观察或用相应荧光抗体与之结合 ,再通过快红等显色剂显色了解有无ＤＮＡ断裂从而了解细胞凋亡 .由于一个凋亡试剂盒所做切片有限 ,因而 ,凋亡试剂显得相对较为昂贵 .进而 ,摸索一些实验方法以增加实验的成功率成为了学者们关心的问题 .本文介绍用本室摸索总结的实验方法检测脊髓的凋亡细胞 .1　材料和方法用 5只成年雄性健康家猫脊髓的Ｌ3节段 ,常规脱水后 ,石…     

原位细胞凋亡技术TUNEL法的改进

目的探索原位末端转移酶标技术（TUNEL）中荧光标记与酶联显色两种方法的关联。方法选择2002—2006年的脑胶质瘤石蜡切片58份,将TUNEL法改良,联合应用荧光标记法与酶联染色两种方法,并应用H2O2减少非特异性着色。结果经改良后的染色背景清晰,荧光标记结果凋亡细胞或凋亡小体为黄绿色荧光小体,酶联显色细胞核棕黄色为阳性。结论 H2O2的应用减少了非特异性着色,蛋白酶K的合理使用避免过表达或表达不足,同时荧光标记法与酶联染色两种方法的联合应用优势互补,最大程度的提高准确性。     

原位凋亡（Apoptosis）细胞末端标记测定TUNEL法

凋亡是单个细胞受其内在基因编程的调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的现象。我们应用非放射性原位末端标记技术，进行凋亡细胞的原位检测。这一方法具有操作简单，结果特异性强、重复性好，特别对于低水平凋亡检测更敏感。     

TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进

目的 :探索避免TUNEL法检测凋亡细胞出现的假阳性和消除非特异性反应的方法。方法 :脑和心肌组织石蜡切片 ,改进的TUNEL染色。选用多聚甲醛固定 ,蛋白酶K修复抗原 ,将H2 O2 封闭内源性过氧化物酶放在反应液标记DNA片段之后 ,先后用小牛血清或羊血清两次封闭非特异性反应。结果 :证实本实验方法避免了假阳性 ,背底十分清亮。结论 :改进后的TUNEL方法适用于凋亡细胞的检测     

TUNEL检测心肌细胞凋亡的影响因素探讨

目的：探讨避免TUNEL法检测心肌细胞凋亡出现的假阳性和消除非特异性反应的方法以及选择合适的蛋白酶K浓度。方法：4%多聚甲醛固定心肌组织,制作石蜡切片。①将试剂盒说明常规步骤加以改良,将0.3%H2O2放在反应液标记DNA片段之后,先后用小牛血清或羊血清两次封闭非特异性反应;②按蛋白酶K不同剂量分为10、20μg/mL蛋白酶K和不加蛋白酶K组（均n=5）,再按照改良的TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：①改良TUNEL法,避免了假阳性,背景清晰;②未加蛋白酶K组较10或20μg/mL蛋白酶K组心肌细胞凋亡率显著减少（均P〈0.05）,两组蛋白酶K组心肌细胞凋亡率差异未见有统计学意义（P〉0.05）。结论：①改良后的TUNEL方法适用于心肌细胞凋亡的检测;②TUNEL法检测心肌细胞凋亡选择10、20μg/mL蛋白酶K是适当的。     

原位细胞凋亡的荧光,酶免疫化学法检测实验研究

用荧光法和酶免疫化学法末端转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）实验分别对小鼠心肌组织、人慢性肝炎肝组织和内膜增生的小型猪血管组织进行了细胞凋亡检测。结果显示：①心肌无凋亡细胞发现，肝组织和血管内膜组织有散在的０～１２个细胞／２５倍物镜视野的细胞标记阳性（凋亡）。②酶免疫化学法ＴＵＮＥＬ实验的检测敏感度较荧光法ＴＵＮＥＬ实验的敏感度高。③过高的末端转移酶可导致假阳性的产生，对荧光法ＴＵＮＥＬ实验，末端转移酶／标记缓冲液比例应为１∶９～１９，而对酶免疫化学法则以１∶５９为好     

原位末端标记和原位杂交技术的改进及其在骨髓细胞凋亡及调控中的应用

目的 细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，是积极主动的生理过程，是在基因调控下细胞的主动死亡。利用文献报道的原位末端标记和原位杂交方法检测骨髓和其他含血细胞较多的组织中的细胞凋亡结果不理想。因此对两种方法进行改进。方法 LACA小鼠，随机分为0、2．5、4．0、5．5及7．0Gy5组。各组动物进行^60Coγ射线全身一次照射。照射后活杀取材，制作骨髓细胞涂片，采用(1)在已有的原位末端标记方法中将亲和素-辣根过氧化物酶(Avidln-HRP)改为碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素(AP-A)；显色剂由DAB改为坚固红。(2)在已有的原位杂交技术中将显色剂NBT和BC／P改为坚固红。结果 (1)改进后的原位末端标记方法显示凋亡的细胞核呈玫瑰红色；正常或未凋亡的细胞核呈浅蓝色，反差明显，背景清晰。(2)改进后的原位杂交显示bcl-2 mRNA阳性结果呈玫瑰红色，背景清晰，胞核复染呈浅蓝色，反差明显。结论 经改进后的原位末端标记和原位杂交技术阳性结果均呈玫瑰红色，胞核复染呈浅蓝色，反差明显，背景清晰。两种方法的改进，解决了长期不能使用原位末端标记和原位杂交技术进行骨髓细胞凋亡规律及调控研究的难题，为其提供了可靠的技术保障。两种方法联合应用于外周血和免疫器官包括脾脏、胸腺、淋巴结等含内源性过氧化物酶丰富的组织细胞凋亡及调控的研究取得了良好结果。因此，本方法值得从事含丰富过氧化物酶细胞如外周血细胞、骨髓造血细胞及免疫组织器官等凋亡及调控研究工作者推广应用。     

肝内肝管细胞癌凋亡的原位末端标记研究

肝内胆管细胞癌(ICC)是肝内胆管上皮发生的癌,属于原发性肝癌的一种亚型,目前细胞凋亡及其调变因素在ICC发病中的作用和地位尚不清楚,ICC调亡的原位末端标记研究国内外尚未见报道.我们参照Wijsman[J Histochem Cytochem,1993;41(1):7]的原位末端标记法,检测了21例ICC的调亡状况,为进一步研究ICC的凋亡与凋变奠定了基础.     

胸腺凋亡细胞DNA裂解的TUNEL原位标记

运用末端脱氧核苷酸转移酶介导的荧光素ｄＵＴＰ缺口末端标记法（ＴＵＥＮＬ）对糖皮质激素诱导的实验性胸腺细胞凋亡的组织切片进行标记，选择性地显示了凋亡细胞，表明ＴＵＮＥＬ可在细胞水平对组织切片中的凋亡进行检测，对细胞凋亡的判定，需结合细胞的形态结构特点，与坏死进行鉴别。     

TUNEL法检测重组vMIP-Ⅱ对SIV感染模型淋巴细胞凋亡的影响

目的　探讨TUNEL技术检测的vMIP -Ⅱ对SIV感染的猴淋巴组织中淋巴细胞凋亡的影响是否与其引起的感染淋巴组织中细胞的增殖有关。方法　取 3个剂量组的vMIP -Ⅱ注射治疗后的SIV感染模型的淋巴组织标本 ,用TUNEL法检测每个剂量组动物模型淋巴细胞凋亡率。结果　vMIP -Ⅱ治疗的 3个剂量组与实验对照组相比、组间相比细胞凋亡率无显著性差异 (P >0 . 0 5 )。结论　 3个剂量组的vMIP Ⅱ对SIV感染后的猴淋巴组织淋巴细胞凋亡无影响 ,但药物剂量与细胞凋亡率却呈负相关。     

新城疫病毒对体外培养人膀胱癌EJ细胞凋亡作用机制研究

目的探讨新城疫病毒(NDV)对体外肿瘤细胞的抑制作用机制。方法以人膀胱癌EJ细胞株为靶细胞,观察NDV对人膀胱癌EJ细胞的作用。结果NDV病毒能作用于体外培养膀胱癌细胞,光镜下细胞的贴壁率和生存率显著下降,电镜下可见到凋亡典型形态结构,TUNEL方法检测膀胱癌细胞有大量凋亡,新城疫病毒作用膀胱癌细胞24h凋亡细胞阳性指数(AI)为9.9%,48h凋亡细胞阳性指数(AI)为17.8%。免疫组化检测膀胱癌细胞有p53、bax、Fas、Fas-L及细胞因子TGFβ1表达增加而原癌基因bcl-2的表达降低从而诱导膀胱癌细胞凋亡。结论NDV病毒是一种有效抗肿瘤细胞的病毒,在体外具有明显的抑制肿瘤细胞作用。     

精子染色质扩散试验及末端转移酶标记法检测精子脱氧核糖核酸完整性

目的 比较精子染色质扩散试验(SCD)和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测精子DNA完整性.方法 对20名已生育的成年健康男性和32例不育患者的精液用上游法筛选得到活动精子,同时进行SCD和TUNEL.结果 不育组和生育组DNA损伤精子百分率的SCD检测结果分别为(12.8±5.8)%和(7.6±3.3)%,2组比较差异有统计学意义(t=3.576,P=0.001);TUNEL检测结果分别为(11.1±5.1)%和(6.8±2.8)%,2组比较差异有统计学意义(t=3.467,P=0.001).SCD与TUNEL检测结果在不育组(r=0.841,P=0.000)和生育组(r=0.823,P=0.000)均具有明显的线性相关关系.生育组SCD检测结果与TUNEL检测结果比较差异无统计学意义(t=1.996,P=0.060),而不育组SCD检测结果明显高于TUNEL检测结果,差异有统计学意义(t=3.023,P=0.005).结论 精子DNA损伤与男性不育有关.与TUNEL比较,SCD是一种更为准确、简单、廉价的检测精子DNA完整性的方法.     

星形细胞瘤及其瘤细胞凋亡的研究:透射电镜与原位细胞凋亡检测

目的 :探讨星形细胞瘤瘤细胞及其凋亡的超微结构变化 ,为阐述肿瘤内在的生物学行为寻找形态学依据 ,分析瘤细胞凋亡与肿瘤恶性转化的关系。方法 :收集本院神经外科手术标本 ,应用透射电镜及原位细胞凋亡试剂盒对星形细胞瘤进行观察和检测。结果 :电镜下发现瘤细胞胞浆内胶质丝与发育不良 /幼稚的细胞器并存 ;瘤细胞核核内假性包涵体 ;瘤细胞间缺乏细胞连接。原位细胞凋亡检测显示 ,星形细胞瘤中低分级组瘤细胞凋亡的细胞密度明显高于高分级组 (P <0 .0 1)。结论 :瘤细胞凋亡的细胞密度随着肿瘤级数的增高而降低 ,提示星形细胞瘤瘤细胞的增殖和凋亡失衡 ,即瘤细胞无限制性增生和 /或瘤细胞不能进入凋亡。这可能是星形细胞瘤发生发展的重要因素。     

CA_(125)、CA_(199)及CA_(153)联合检测对肺癌的诊断价值

目的 :评价血清 CA12 5、CA199、CA153联合检测对肺癌诊断及分期的临床价值。方法 :用免疫放射分析法测定 72例不同类型及分期的肺癌患者 ,46例肺良性疾病患者及 38例健康体检者血清 CA12 5、CA199、CA153水平的变化。结果 :肺癌组血清 CA12 5、CA199、CA153水平均高于正常对照组及肺良性疾病患者 ,有显著性差异 ,且 TNM分期越晚 ,其水平越高。 3项肿瘤标志联合检测可提高敏感性及准确性。结论 :CA12 5、CA199、CA153联合检测可以为肺癌的诊断及分期提供有价值的实验室依据。     

多肿瘤标志物蛋白芯片对食管癌诊断的临床评价

目的:探讨多肿瘤标志物蛋白芯片(C-12)对食管癌诊断的价值。方法:应用C-12同时检测37例食管癌患者、52例消化系统良性疾病患者和65例健康体检者血清中CA199、CEA、AFP、CA125、Ferritin、β-HCG、HGH、CA153、CA242、PSA、f-PSA和NSE共12项肿瘤标志物的表达水平,筛选出与食管癌相关性最强的肿瘤标志物及标志物组合,并盲法验证最佳标志物组合的诊断价值。结果:食管癌组与良性疾病组和正常对照组相比,CA199、CEA、Ferritin、AFP、CA125和C-12的检测阳性率差异有统计学意义,食管癌组中CEA、Ferritin、β-HCG、CA125和HGH的表达水平显著高于良性疾病组和对照组。对食管癌诊断价值最高的肿瘤标志物是CEA,检测的敏感性、特异性和准确性分别为40.5%、98.5%和77.5%。不同标志物联合检测组合中,最佳4项组合CEA+Ferritin+CA199+CA125的敏感性、准确性最高,但与C-12相比,差异均无统计学意义。盲法验证最佳4项组合联合检测食管癌的敏感性为75.0%,特异性为90.0%,准确性为82.5%。结论:C-12对食管癌具有较高的诊断价值,最佳4项组合(CEA+Ferritin+CA199+CA125)联合检测足以替代C-12的12项肿瘤标志物联合检测,可能是一种既经济又有效的诊断食管癌的标志物组合。     

以冠状动脉造影结果重新评价心电图对冠心病的诊断价值

[目的]了解拟诊为冠心病患者的心电图(ECG)改变在诊断冠心病方面的价值。[方法]对375例拟诊为冠心病的患者的心电图和冠状动脉造影(CAG)的结果进行分析。[结果]375例中252例ECG异常,123例正常;经冠状动脉造影检查,278例确诊为冠心病,97例除外冠心病;心电图异常的252例有205例诊断为冠心病,心电图正常的123例有73例诊断为冠心病,ECG诊断冠心病的敏感度(sensitivity)为73.7%,特异度(specificity)为51.5%;心电图的不同改变对于冠心病的诊断意义不同(P<0.001)。异常Q波的96.8%、ST段抬高的90.0%、ST段下移的83.7%诊断为冠心病。[结论]拟诊为冠心病患者进行普通体表心电图检查的价值有限,其不同导联所致的不同改变对诊断冠心病的意义不同。     

腹阴联合超声诊断异位妊娠82例

目的探讨经腹（TAS）与经阴道超声（TVS）在异位妊娠诊断中的应用价值。方法回顾分析临床确诊的82例经TAS及TVS诊断的异位妊娠患者临床资料。结果总体诊断符合率为96％,其中TAS诊断符合率80．5％,TVS诊断符合率为95．1％。结论宫外孕的超声图像表现有一定的特征,TVS能提高检查阳性率,但也有局限性,必要时可以二者联合应用。     

~(99m)Tc-NOET与~(201)T1心肌显像在冠心病诊断中的对比研究

目的： 比较９９ｍＴｃＮＯＥＴ（ＮＯＥＴ：Ｎ乙氧基Ｎ乙基氨荒酸钠）和２０１Ｔ１ 心肌显像在冠心病（ＣＨＤ） 诊断中作用。方法：ＣＨＤ组：２３ 例,其中冠脉造影１４ 例;对照组：８ 例,其中冠脉造影２ 例。所有对象均进行９９ｍＴｃＮＯＥＴ及２０１Ｔ１ 运动—再分布ＳＰＥＣＴ显像。结果：①运动及再分布显像的心肌节段的放射性摄取一致性分别为２６９／２７９（９６．４％ , Ｋ ＝ ０．８９ ±０．０６） 和２６０／２７９（９３．２％ ,Ｋ＝０．７９±０．１８） ,一致性极好。②在本研究中,９９ｍＴｃＮＯＥＴ心肌显像诊断ＣＨＤ的敏感性和特异性分别为９１．３％ 、８７．５％ ,而２０１Ｔ１ 分别为８６．９％ 、８７．５ ％ 。９９ｍＴｃＮＯＥＴ和２０１Ｔ１ 显像诊断冠脉病变的敏感性和特异性分别为７１．４％ 、８５．０％ 和７５．０％ 、８５．０％ ,两者比较均无显著性差异。③再分布心肌节段一致性达８０％ 。结论：９９ｍＴｃＮＯＥＴ心肌显像在冠心病上的作用与２０１Ｔ１ 相似;两种显像剂在正常心肌内动力学基本相似,但灌注异常的心肌节段有一定差异,机理不详,可能是两者生物行为不同所致。     

PRINS技术标记绒毛细胞间期核21号染色体的研究

目的 探索妊娠早期诊断唐氏综合征的新方法。方法 应用21号染色体特异的α-卫星DNA序列引物对7份早孕绒毛间期细胞标本进行了引物原位标记反应。结果 7份标本中，平均93％的细胞核显示2个标记信号。荧光信号清晰明亮，整个反应在4－内完成。结论 引物原位标记技术可于妊娠早期快速检测绒毛间期细胞21号染色体数目异常，可用于唐氏综合征的产前诊断。     

甲状腺素对重型颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡、NSE及IL-6的影响

目的 通过观察甲状腺素对重型颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡、血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素(IL)-6的影响及血清FT3、FT4的改变,探讨甲状腺素对重型颅脑损伤脑组织的保护作用.方法 90只SD大鼠分为对照组、模型组、左甲状腺素钠片低剂量组、左甲状腺素钠片中剂量组、左甲状腺素钠片高剂量组5组,每组各18只,参照Feeney's自由落体打击造模法复制动物模型;于伤后6h灌胃.灌胃后24、72、168 h分别通过TUNEL法、ELISA法及放射免疫法检测神经细胞凋亡、血清NSE、IL-6及血清FT3、FT4水平.结果 (1)重型颅脑损伤大鼠受伤后血清FT3、FT4水平低于正常水平,FT4在168h降到最低,甲状腺素可使FT3、FT4水平升高.(2)重型颅脑损伤大鼠受伤后出现明显的神经细胞凋亡,这种凋亡持续至168 h.中剂量及高剂量甲状腺素在24 h即可以改善神经细胞凋亡,低剂量甲状腺素在168 h才可以改善神经细胞凋亡.(3)重型颅脑损伤大鼠血清NSE、IL-6于伤后明显升高,一直持续到168 h.中剂量及高剂量甲状腺素在72 h即可以降低血清NSE、IL-6水平.结论 外源性甲状腺素对重型颅脑损伤大鼠脑组织具有保护作用.