细胞端粒酶活性的定性及定量分析

对Ｋｉｍ等的端粒重复序列ＰＣＲ扩增法加以改进，用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色代替ＥＢ染色，建立了细胞端粒酶活性的ＰＣＲ－ＴＲＡＰ定性分析法；同时，用γ－＾３２Ｐ－ＡＴＰ标记ＴＳ引物，加入内对照ＴＳＫ１，建立了ＰＣＲ－ＴＲＡＰ定量分析法。利用上述方法，对１２株人肿瘤或非肿瘤细胞进行端端酶活性分析，结果发现，所有被检细胞株均呈端酶阳性，但其活性水平在不同细胞株间有较大差异（２３￣６５２ＴＰＧｕｎｉｔｓ）。     

用TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE测定鼻咽癌端粒酶活性的比较

目的：比较ＴＲＡＰ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ及ＴＲＡＰ ＰＣＲ ＰＡＧＥ检测鼻咽癌端 酶的活性。方法：分别采用ＴＲＡＰ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ及ＴＲＡＰ ＰＣＲ ＰＡＧＥ检测了３８例鼻咽癌（ＮＰＣ）、１５例癌旁组织、１９例慢性鼻咽炎和鼻咽癌ＨＮＥ１细胞株、其它２种癌细胞株及３种正常细胞的端粒酶表达,并探讨了在不同数量的ＨＮＥ１细胞中端粒酶表达的灵敏度及ＨＮＥ１细胞株、５例ＮＰＣ活检组织经热灭活后端粒酶检测的     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

甲状腺乳头状癌端粒酶活性的研究

目的 通过检测甲状腺乳头状癌中的端粒酶活性,探讨其在甲状腺乳头状癌中潜在的临床价值。方法 采用ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ定量及ＴＲＡＰ－ＰＣＲ银染定性法,对４９份甲状腺组织进行端粒酶活性的分析。结果 ２３例甲状腺乳头状癌组织中端粒酶阳性率为８６．９％,其活性水平与组织学分级无关,病灶越大,年龄越大,病期越晚,端粒酶活性水平越高,淋巴结转移者高于无转移者。１０例甲状腺正常组织端粒酶皆为阴性。８例甲     

检测端粒酶活性的PCR—ELISA方法的建立

建立一种更为敏感，特异的端粒酶检测方法。方法将分子生物学和免疫学方法有机地结合起来，建立ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法并检测多种肿瘤细胞株和部分组织中端粒酶活性。结论ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法检测端粒酶活性是一种简便，快速，无放射性污染的方法，适用于肿瘤早期诊断和普查。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

银染的端粒重复序列扩增法检测人细胞端粒酶活性的研究

目的：探讨应用简便，快速及无害化的非核素银染端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ）检测人细胞端粒酶活性。方法：与枝素ＴＲＡＰ相比较，采用非核素银染ＴＲＡＰ检测了２９３细胞，并检测了经ＲＮａｓｅ和加热处理的阴性对照标本和ＱＧＹ７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１ ２株人肝癌细胞。     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

应用非同位素aPCR-SSCP法检测P53基因突变

建立一种非同位素的不对称聚合酶链反应－单链构象多态性技术（ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ）：通过不对称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）获得单链，普通ＰＡＧＥ电泳分离，经银染快速准确检出突变；应用这种方法，研究了４株鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１，ＣＮＥ２，ＨＫ１和ＳＵＮＥ１中肿瘤抑制基因Ｐ５３基因突变，证实ＣＮＥ１，ＣＮＥ２在第８外显子，ＨＫ１在第５外显子有突变，并发现新建立的细胞株ＳＵＮＥ１存在第８外显子的突变。     

B细胞活化因子B7—1cDNA的克隆及其在白血病细胞的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从ＥＢＶ转化Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ、酶切Ｂ７－１基因和逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，连结、克隆ＰＬＢ７－１ＳＮ到大肠杆菌Ｍｃ１０６１。扩增纯化质粒ＰＬＢ７－１ＳＮ。用ＰＡ３１７细胞包装病毒，ＮＩＨ３Ｔ３细胞筛查病毒滴度，获得高效价的Ｂ７－１病毒上清，病毒感染人白血病细胞株Ｋ５６２和ＨＬ６０，获得稳定表达Ｂ７－１分子的肿瘤细胞。     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅱ.HSV—tk／A …

采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ＴＫ基因的ＰＣＲ和病理切片观察,分别将ＰＡ３１７／ＢＡＧ,ＰＡ３１７／ＴＫ产病毒细胞注射动物体内,结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过１个月;产病毒细胞在体内有形成肿瘤,也没有发现严重的炎症 反应;ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗,ＡＣＶ及其代谢物产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＶＣ系统的在动物体内取得了安全的结果。     

癌性胸水脱落细胞端粒酶活性表达初步研究

目的：建立银染－ＴＲＡＰ法检测胸水脱落细胞端粒酶活性，探讨银染－ＴＲＡＰ法用于胸水，脱落细胞中端粒酶活性研究的可行性。方法：应用银染－ＴＲＡＰ法检测３０例癌性胸水脱落细胞和３０例结核性胸膜炎胸水脱落细胞端粒酶活性的表达。结果：癌性胸水脱落细胞端粒酶活性为１００％（３０／３０）表达，对照组胸水脱落细胞端粒酶活性为阴性（Ｐ＜０．０１）。结论：癌性胸水脱落细胞中存在端粒酶活性；端粒酶活性与癌性胸水的形成原因有关；银染－ＴＲＡＰ法是一种敏感、可靠且简便、快速和经济的方法，适用于临床实验室进行大规模的样本筛选。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

维甲类化合物Ro13—7410对白血病细胞端粒酶活性的抑制

为深入探讨第三代维甲类化合物Ｒｏ１３－７４１０诱导白血病细胞凋亡和分化的机制。本文采用ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ－ＰＡＧＥ两种方法观察了ｏ１３－７４１０对ＨＬ－６０细胞端粒酶活性的影响。实验结果显示在Ｒｏ１３－７４１０诱导ＨＬ－６０细胞亡和分化的过程中端粒酶活性逐渐下降，结论：Ｒｏ１３－７４１０能明显抑制ＨＬ－６０细胞端粒酶活性，且可能与白血病细胞的增殖抑制和诱导凋亡及分化作用有关。     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

蠲哮汤对哮喘患者血栓素B2／6—酮—前列腺素F1α,超氧化物歧化…

报告以ＴＸＢ２／６－Ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α，ＲＢＣ－ＳＯＤ为实验指标，探究蠲哮汤治疗轻，中度支气管哮喘发作的机理。在蠲哮喘汤药效的同时哮喘患者ＴＸＢ２／６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α，ＲＢＣ－ＳＰＤ较治疗前均下降，缓解组ＴＸＢ２／６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α较健康组升高，ＴＲＢＣ－ＳＯＤ则下降，表明蠲哮汤对轻，中度哮喘发作可能通过降低ＴＸＢ２／６－Ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α值，增加了ＲＢＣ－ＳＯＤ调节值起治疗作用。     

人IL—4重组逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达

利用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法，从ＰＣＤ－ｈＩＬ－４质粒中扩增得到人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）的ｃＤＮＡ－。ＤＮＡ序列测定证实此片段包含完整的ＩＬ－４开放阅读框架。应用ＤＮＡ重组技术，将此ｃＤＮＡ重组于逆转录病毒载休ＬＸＳＮ。用脂质体转染法将此重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７。得到滴度为２．５ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ的感染性病毒。病毒感染人白血病细胞株ＨＬ－６０、Ｋ５６２及Ｂｕｒｋｉｔ淋巴瘤细胞株Ｒａｊｉ，使之表达并分泌ＩＬ－４。逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法证实ｈＩＬ－４ｃＵＮＡ可在上述肿瘤细胞中持续转录。ＥＬＩＳＡ怯证实病肿瘤细胞分辨ＩＬ一４水平可高达３００Ｐ／１０细胞．２４小时。本研究为进一步探讨转ＩＬ一４基因用于血液系统恶性肿瘤免疫治疗的价值提供了基础。     

端粒酶活性及其hTR表达在诱导大肠癌分化细胞中的变化

目的 观察全反式维甲酸（ＡＴＲＡ０和１，２５－二羟维生素Ｄ３（ＶＤ３）大肠癌细胞株诱导分化过程中粒酶活性的变化，并对其ＲＮＡ组分ｈＴＲ进行检测。方法 ＡＴＲＡ和ＶＤ３对大肠癌细胞进行诱导分化，在进行细胞活力测定，细胞增殖测定，流式细胞仪（ＦＣＭ）分析细胞周期及碱性磷酸酶比活性测定的时时，分别在诱导后第２天，第４天和第６天用ＴＲＡＰ法检测其端粒酶活性的变化，并同时用ＲＴ－ＰＣＲ的方法对端粒酶的ＲＮＡ     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

维甲酸和三氧化砷对急性早幼粒细胞性白血病细胞组织因子表 …

目的 探讨全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）在体内外对急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞组织因子（ＴＦ）表达的意义。方法 利用复钙时间测定、ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法,分别检测了ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３治疗前后ＡＰＬ患者（２３例）骨髓单个核细胞的促凝活性、ＴＦ抗原及其ｍＲＮＡ的转录水平,同时还检测了使用ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３处理ＡＰＬ细胞株ＮＢ４－Ｒ１细胞以及转染ＰＭＬ－ＲＡＲａ融