无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特征

背景：前期研究表明，无细胞基质的组织工程膀胱支架材料有良好的生物相容性，无毒可吸收，符合组织工程生物支架材料的部分应用要求。目的：实验拟进一步观察无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特性。设计、时间及地点：对比观察实验，于2006—07／2007—05在中国医学科学院北京协和医院中心实验室和北京大学高分子科学与工程系完成。材料：新鲜猪膀胱。方法：采用低渗．去污剂洗涤．核酸酶消化法对新鲜猪膀胱组织进行脱细胞处理，制备无细胞基质膀胱。对新鲜猪膀胱组织及制备的膀胱无细胞基质行苏木精-伊红染色和Masson染色。主要观察指标：测定膀胱组织在脱细胞前后组织的厚度、组织含水量、可溶性蛋白含量、最大位移、最大应力和断裂应力。结果：与新鲜膀胱组织相比，脱细胞后的膀胱组织中未见有细胞成分，保留了完整的细胞外基质。膀胱组织含水量在脱细胞后明显增加（P〈0．001），组织厚度和可溶性蛋白含量明显降低，而经校正后的应力-应变参数及破坏强度则改变不明显。结论：无细胞基质膀胱与天然组织的生物力学特性一致或接近。     

猪源性膀胱无细胞基质在异种移植中的生物安全性

背景：猪异种移植过程中可能发生猪内源性反转录病毒跨种间传播的潜在危险，由此所带来的异种移植生物安全性问题逐渐受到关注。 目的：观察去细胞过程对猪膀胱内源性反转录病毒的影响，以评价猪源性膀胱无细胞基质生物工程材料在异种移植中的生物安全性。 设计、时间及地点：基因工程与组织工程动物体内实验，于2006—07／2007—03在中国医学科学院北京协和医院中心实验室完成。 材料：正常健康雄性杂种犬8只，随机分为对照组2只，修补组6只，用于膀胱修补替代实验。取材0．5h内的猪新鲜膀胱标本采集自屠宰厂。 方法：采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理，制备膀胱无细胞基质移植物。对照组犬切除50％膀胱后原位直接缝合，不使用任何材料修补；修补组犬切除50％膀胱后，分别用面积约为原膀胱30％，40％，50％的膀胱无细胞基质移植物进行替代修补。分别于移植前及移植后1个月抽取犬静脉血提取RNA和DNA，以猪Beta-actin序列片段扩增产物作为内参照，针对内源性反转录病毒gag区序列，选用特异性引物，采用PCR和RT-PCR法检测上述提取的DNA和RNA是否存在内源性反转录病毒序列片段，并对扩增产物进行测序用于同源性分析。 主要观察指标：苏木精-伊红染色观察猪膀胱去细胞效果及DNA含量。PCR及RT-PCR扩增及测序结果。 结果：经去细胞处理后，猪膀胱内的细胞成分完全去除，三维纤维支架保持完整，DNA含量低于1％。新鲜猪膀胱PCR和RT-PCR均检测到362bp扩增条带，与Medline公布的内源性反转录病毒有94％的同源性；所制备的生物工程材料膀胱无细胞基质移植物、及其移植前后的犬外周血样本均未检测到内源性反转录病毒序列的表达。 结论：低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法制备的膀胱无细胞基质移植物可以去除猪膀胱内源性反转录病毒，能够有效预防内源性反转录病毒在物种间的交叉感染，具有良好的生物安全性，可作为生物工程材料进行异种移植相关实验。     

本期专题：脱细胞组织基质来源的生物材料（本刊中文部）

推荐理由：传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱，并进行支架材料的双面种植，但由于平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限，双面种植较为困难。文章拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性。实验采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质，并测定其纯度及特性。将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上，     

膀胱无细胞基质移植物重建兔阴茎白膜的动态观察

背景:目前膀胱无细胞基质移植物已成功用于替代动物膀胱、尿道和修复尿道下裂,但膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜有待观察.目的: 采用同种异体膀胱无细胞移植物替代兔阴茎白膜,观察重建修复效果. 设计:随机对照观察.单位:四川大学华西医学实验动物中心、华西组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室.材料:选用50只雄性健康封闭新西兰兔,动物级别3级,体质量为2.6～3.0 kg,均无包茎及阴茎发育不良,注射生理盐水后无阴茎弯曲,由四川大学华西实验动物中心提供.方法:实验于2005-12/2007-06在四川大学华西实验动物中心、四川大学组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室完成.①取10只实验兔膀胱制备膀胱无细胞基质移植物.随机数字表法将40只新西兰兔分为对照组和膀胱无细胞基质移植物组,分别在阴茎背侧切除白膜10 mm×5 mm造成缺损,分别采用白膜原位缝合及膀胱无细胞基质移植物修复,每组20只.②分别于术后2,6,12及24周对2组动物进行阴茎海绵体内快速注射生理盐水诱导阴茎勃起,观察阴茎弯曲情况;于上述时间点分别处死实验兔,于术区取材进行苏木精-伊红、Masson染色观察修复部位组织结构变化;Stirus 染色检测检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积,免疫组化染色检测炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达.主要观察指标:①阴茎弯曲情况.②修复部位组织结构变化.③炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达.④Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积.结果:纳入重建阴茎白膜术实验兔40只,2只死于麻醉药物过量,2只死于急性肠炎,其余36只均进入结果分析.①术后6周时弯曲发生率最高,对照组2例,膀胱无细胞基质移植物组1例;术后12周对照组及膀胱无细胞基质移植物组各1例发生弯曲;术后24周对照组1例发生弯曲,膀胱无细胞基质移植物组无弯曲发生.②修复部位组织结构变化:术后2周两组修复部位结构欠清,炎性细胞浸润明显,膀胱无细胞基质移植物组移植部位可见膀胱无细胞基质移植物内细胞生长,Masson染色显示术区白膜纤维纤细,排列欠规律.术后6周时白膜恢复完整性,膀胱无细胞基质移植物不能辨别,两组间无明显差异.术后24周移植部位白膜完整均匀,纤维恢复内环外纵排列,和正常白膜不能区别.③两组术后诱导型一氧化氮合酶及转化生长因子β1,2周表达最强,术后6周只有少数纤维细胞和血管内皮细胞有表达,术后12,24周仅有极少的血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1,同时间点2组诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1没有差别.④术后2周两组Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维共同存在,比例相当.以后Ⅰ型胶原纤维逐渐增加,而Ⅲ型胶原纤维逐渐减少,术后24周以Ⅰ型胶原纤维为主,Ⅲ型胶原纤维已不明显.结论:膀胱无细胞基质移植物修复新西兰兔阴茎白膜无明显的炎症反应和纤维化,是较为理想的阴茎白膜修复材料.     

超高压脱细胞技术制备组织工程带瓣血管支架

背景:研究表明同种瓣膜移植术后发生的退行性变性与其留存的细胞成分激发宿主免疫反应有显著的相关性.目的:采用超高压结合核酸酶洗涤方法处理猪带瓣膜血管,观察瓣膜脱细胞的效果及猪内源性反转录病毒的去除情况.设计,时间及地点:对比观察实验,于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成.材料:实验选用月龄1～3个月的健康雄性迷你猪幼猪,体质量3～5kg.方法:无菌条件下取出猪带瓣肺动脉血管,分为3组:对照组:无任何处理.表面活性剂组:将带瓣管道用Triton X-100溶液浸渍、搅拌24h后洗净.超高压处理组:用超高压设备以981MPa超高静水压(4℃)将供体来源细胞压碎,结合核酸酶的消化作用,磷酸盐缓冲液的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成带瓣膜血管支架.主要观察指标:光镜下观察支架形态结构,透射电镜下观察支架细胞成分去除和支架纤维保留情况,扫描电镜观察支架表面的超微结构.观察两种方法处理瓣膜的弹性率差异.检测猪内源性反转录病毒前病毒DNA.定量检测超高压脱细胞前后带瓣管道中DNA含量的变化.结果:①超高压处理组瓣叶及瓣根组织表面及内部细胞完全消失,保留了细胞外基质,DNA含量显著降低.表面活性剂组瓣根组织深部的细胞无法渗透、除去.②超高压处理组瓣膜弹性率几乎不变,瓣膜功能保持较好.表面活性剂组瓣膜弹性率增加.③超高压处理组猪内源性反转录病毒被成功灭活,无法测出.表面活性热组无法将猪内源性反转录病毒灭活.结论:采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分,可将P,1源性反转录病毒成功灭活,保持了细胞外基质结构和功能的完整性,脱细胞效果优于表面活性剂方法.     

骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化

背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.     

超高压脱细胞方法制备组织工程血管支架

背景:构建组织工程血管支架的研究多集中于生物可降解支架和脱细胞同种或异种血管支架方面,但存在急需解决的若干问题:如生物可降解支架生物降解速度的控制以及植入脱细胞天然血管支架可能带来供体来源病毒细菌感染受体问题等.目的:采用超高压结合核酸酶洗涤方法(超高压脱细胞技术)处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性反转录病毒的去除情况.设计:对比观察实验.单位:日本国立心血管病中心研究所.材料:实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成.选用健康雄性迷你猪幼猪,由日本九州鹿儿岛Japan Farm食用猪养殖场提供,体质量3～5 kg,猪龄1～3个月.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验涉及的主要试剂和仪器:Hoechst 33258为日本同仁化学研究所产品;超高压设备KOBELCO为神户制钢所产品:PCR为GENEAMP PCR SYSTEM 9700产品.方法:实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成.无菌条件下取出猪降主动脉血管,用超高压设备以981 Mpa超高静水压(4 ℃)将供体来源细胞压碎,结合核酸酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架.主要观察指标: ①利用Hcechst 33258荧光探针,定量检测超高压脱细胞血管中DNA含量;用JEM100cx型透射电镜观察血管组织细胞成分去除和支架纤维保留情况;用JBM5200型扫描电镜观察支架的超微结构;100倍光镜下观察血管壁形态结构.即从组织学、分子生物学、免疫组组织化学水平评估超高压脱细胞方法的抗原去除效果. ②用PCR方法检测幼猪脱细胞血管中的猪内源性反转录病毒(PERV)前病毒DNA,评估超高压脱细胞方法对以猪内源性反转录病毒为代表的病原微生物的杀灭效果.结果: ①血管壁形态结构:血管壁纤维波浪状结构保存完好,组织? 内的细胞均被除去. ②细胞去除效果:透射电镜见细胞成分均已消失.但保留有胶原纤维和弹性纤维.扫描电镜可见细胞已被完全脱去,只剩脱细胞支架. ③病原微生物的杀灭效果:经过超高压处理,猪内源性反转录病毒被成功灭活,无法测出.而采用表面活性剂脱细胞组无法将猪内源性反转录病毒灭活. ④DNA含量:超高压脱细胞处理前,血管中DNA含量为(31.7±3.5) mg/L;超高压脱细胞处理后,DNA含量为(1.16±0.23)mg/L,DNA含量显著降低(P＜0.01).提示超高压脱细胞方法已将细胞核及内容物大部分除去.结论:实验证明采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分,可以将病源微生物杀灭(将猪内源性反转录病毒成功灭活).     

猪膀胱无细胞基质的制备及其对异种血清的反应性

目的:介绍猪膀胱无细胞基质的制备方法并观察其与异种血清是否存在抗原抗体结合反应。方法:实验于2002-01/2003-01在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军“三优”实验室完成。新鲜贵州香猪3只,其膀胱用生化方法脱细胞制备膀胱无细胞基质;分别以人AB,O,A,B型、大鼠、兔血清为一抗,免疫组织化学方法观察猪正常膀胱组织、膀胱无细胞基质分别对不同血清的结合情况。结果:实验贵州香猪3只均进入结果分析。①用生化脱细胞方法可成功制备富含胶原等细胞外基质的膀胱无细胞基质。②由贵州香猪全层膀胱制备的膀胱无细胞基质对异种血清的抗原抗体反应均为阴性;正常膀胱组织与异种血清均存在抗原抗体结合反应,主要发生于膀胱固有层及肌间隙的血管壁。结论:贵州香猪膀胱可用生化脱细胞方法制备以细胞外基质成分为主的组织工程天然材料;制备成功的膀胱无细胞基质已不存在可能导致异种移植后超急性排斥反应的靶抗原。     

小口径组织工程血管脱细胞生物支架材料的研究

目的探索利用生物酶类联合消化法制备猪颈总动脉脱细胞基质材料的方法,为小口径组织工程血管提供理想的生物支架材料。方法利用胰酶和核酸酶连续消化法脱除成年猪颈总动脉的细胞成分;通过组织学染色和定量DNA分析,检测细胞及细胞碎片的去除情况;利用扫描电镜观察脱细胞支架材料的空间结构和细胞去除情况。结果组织学染色结果显示,制备的猪颈总动脉脱细胞支架材料不含有细胞成分,细胞外基质成分没有明显的改变,保留了脱细胞前动脉的空间结构;DNA定量分析结果显示,支架材料的DNA含量小于0.1%;扫描电镜结果显示,支架材料的内表面完全去除了内皮细胞成分,显示出良好的三维空间结构。结论利用胰酶和核酸酶连续生物酶消化法制备的猪颈总动脉细胞外基质支架材料中细胞成分去除完全,细胞外基质的空间结构保持良好,制备的支架材料符合小口径组织工程血管对生物支架材料的基本要求。     

人脐静脉脱细胞基质的制备

背景:细胞外基质的制备以去除组织中的细胞成分为目的,目前脱细胞方法尚无统一的标准,但是制备的细胞外基质均需证实有无细胞残留.目的:观察应用酶消化、去污剂、渗透溶液方法和TritonX-100与氨水混合液方法制备脐静脉脱细胞基质的效果,以探讨制备人脐静脉脱细胞基质的理想方法.方法:分别采用酶消化、去污剂、渗透溶液法和曲拉松与氨水混合液两种方法处理人脐静脉,制备人脐静脉脱细胞基质.观察脱细胞处理前后脐静脉基质的物理性状和苏木精-伊红染色结果,随机观察50个400倍镜像下残留细胞碎片数目.结果与结论:脐静脉经脱细胞处理后呈瓷白色半透明胶冻样管状结构.酶消化、去污剂、渗透溶液方法组的人脐静脉细胞成分几乎全部去除,细胞外基质保持完好,纤维结构完整,曲拉松与氨水混合液方法组有不同数量的残余细胞成分,两组差异具有显著性意义(P < 0.05).结果表明,酶消化、去污剂和渗透溶液法是制备人脐静脉脱细胞基质较为理想的方法.