mPer2对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖作用的影响

目的:研究mPer2对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖作用的影响。方法:将构建好的mPer2全长表达质粒(pcDNA3.1-mPer2)转染入小鼠黑色素瘤细胞B16中,并以pcDNA3.1空质粒转染为对照,通过平板克隆形成实验和MTT法检测两组细胞的增殖情况。结果:平板克隆形成实验和MTT法检测结果均显示Period2转染组小鼠黑色素瘤细胞B16较空质粒对照组明显降低。结论:mPer2的高表达能显著性的抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的生长。     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

反义核酸抑制B16黑色素瘤细胞tyr基因的表达

目的：用反义核酸技术抑制小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因（tyr）的表达。 方法： 构建tyr反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，用脂质体法导入B16细胞，用酪氨酸酶活性及黑色素含量测定，多巴染色及透射电镜等检测由反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr转录产生的tyr反义核酸对B16细胞tyr表达的抑制情况。 结果： 成功构建了反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，转染了反义重组体的B16细胞其酪氨酸酶活性为0.0498±0.0036，显著低于对未转染组B16细胞的0.0916±0.0132(P<0.01);转染空质粒pcDNA3.1(-)及真核表达重组体pcDNA3.1(+)-tyr组B16细胞的氨酸酶活性分别为0.1015±0.0166和0.0948±0.0096,两者同对照组相比均无显著差异(P>0.05)。多巴染色及电镜观察结果表明转染了反义重组体的B16细胞其黑色素颗粒的含量明显低于对照组。 结论： 反义核酸可以显著抑制B16黑色素瘤细胞tyr的表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

抑制或过表达GRK5 基因对星形胶质细胞凋亡及IL-1β和TNF-α表达的影响

目的:探讨抑制或过表达G 蛋白偶联受体激酶5(GRK5)基因对星形胶质细胞(AS)凋亡及IL-1β和TNF-α 表达的影响。方法:培养原代AS,将干扰GRK5 表达的siRNA(GRK5-siRNA)及GRK5 的过表达质粒(pcDNA3.1-GRK5)分别转染AS,通过Western blot 检测转染24 h 后的细胞中GRK5 蛋白的表达;缺氧处理AS,细胞分为空白组、缺氧组、缺氧+pcDNA3.1-GRK5 组和缺氧+GRK5-siRNA 组,缺氧处理24 h 后通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及ROS 含量;RT-PCR检测IL-1β和TNF-α的mRNA 表达;Western blot 检测p53、信号转导与转录因子3(STAT3)和p-STAT3 蛋白表达。结果:与空白组比较,转染GRK5-siRNA 的AS 中GRK5 的表达显著降低,转染pcDNA3.1-GRK5 的细胞GRK5 的表达显著升高(P <0.05);与空白组比较,缺氧组细胞凋亡率、ROS 水平及IL-1β、TNF-α、p53 和p-STAT3 的表达均显著升高(P<0.05);与缺氧组比较,缺氧+pcDNA3.1-GRK5 组细胞凋亡率、ROS 水平及IL-1β、TNF-α、p53 和p-STAT3 的表达均显著降低,缺氧+GRK5-siRNA组细胞凋亡率、ROS 水平及IL-1β、TNF-α、p53 和p-STAT3 的表达均显著升高(P<0.05)。结论:过表达GRK5 可降低AS 凋亡和ROS 水平,下调IL-1β、TNF-α、p53 表达及STAT3 信号通路,抑制GRK5表达反之。     

过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响

目的:评价过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响。方法:用PMA刺激NIH3T3细胞,使节律基因稳定表达后,用脂质体介导方法将质粒pcDNA3.1/Gnb2l1转染至NIH3T3细胞,并以空载体质粒pcDNA3.1/vector为对照。利用RT-PCR技术检测不同时间点Gnb2l1 mPer1在NIH3T3细胞中的表达水平,研究过表达Gnb2l1基因对mPer1基因表达的影响。结果:采用RT-PCR技术显示成功转染,实验组比对照组Gnb2l1表达量明显增高(p0.05)。并且发现实验组的mPer1表达量比对照组明显增高,但是经过余弦分析发现两组相比mPer1的表达周期无明显改变。结论:成功过表达Gnb2l1基因使节律基因mPer1表达量增加,中值增高(p=0.038)。     

TFDP3对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡调控作用的初步研究

目的:研究TFDP3对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡作用的影响,以及探讨TFDP3与E2F1相互作用后对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡的调控作用。方法:采用重组质粒pcDNA3.1-TFDP3,pCMV-E2F1-HA分别转染LNCaP细胞,并设空载体对照组。转染24 h后提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR检测TFDP3、E2F1、以及LC3B基因表达的变化,Western blot方法检测自噬相关基因(LC3B)蛋白表达水平的变化。并采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果:TFDP3可以诱导LNCaP细胞中自噬基因LC3B的表达,并且这种作用可以受到E2F1的抑制;TFDP3可以抑制E2F1诱导的细胞凋亡。结论:TFDP3可以诱导LNCaP细胞中自噬基因LC3B的表达,可以抑制E2F1诱导的细胞凋亡,提示TFDP3在前列腺癌细胞中发挥着重要的调控作用。     

肿瘤抑制因子RUNX3对人胃癌细胞中凋亡相关基因表达的影响

 目的：研究肿瘤抑制因子人类Runt相关转录因子3(RUNX3)对人胃癌细胞BGC823中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（bcl-2）、bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（caspase-8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）表达的影响,以揭示RUNX3促进胃癌细胞凋亡的作用机制。方法：首先构建人Runx3的真核生物表达载体pcDNA3.1- Runx3,将pcDNA3.1-Runx3及空载体pcDNA3.1分别转染BGC823细胞48 h后,提取细胞的总RNA和蛋白质,应用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)和蛋白免疫印迹（Western blotting）分别检测转染不同载体的细胞内RUNX3的表达情况,然后用RT-PCR和Western blotting检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达及蛋白的表达,β-actin作为内对照。结果：我们成功构建了人Runx3的真核生物表达载体pcDNA3.1-Runx3,将其转染BGC823细胞后,RT-PCR和Western blotting结果均显示：转染pcDNA3.1-Runx3的细胞中RUNX3的表达水平明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞(P<0.05);转染pcDNA3.1-Runx3的细胞中bcl-2基因的表达水平明显降低,caspase-3、caspase-9基因的表达水平明显增加(P<0.05)。结论：在BGC823细胞中,RUNX3通过下调bcl-2,上调caspase-3、caspase-9的表达促进细胞的凋亡。     

EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证

目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白转录抑制抑癌基因p53表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法 以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础，利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域（p53p），构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p；以该质粒单独及与pcDNA3．1（-）-X共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。进一步采用半定量RT-PCR技术检测HBV X蛋白对p53基因表达的调节。结果 成功构建报告载体pCAT3-p53p，克隆的p53启动于有顺式激活下游基因的活性；pCAT3-p53p与pcDNA3＋1（-）-X共转染时CAT的表达活性明显下降，说明HBVX蛋白抑制p53基因启动子的转录。RT-PCR结果表明，转染了pcDNA3．1（-）-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。结论 HBV X蛋白在转录水平上反式抑制抑癌基因p53的表达，本实验不仅验证了基因芯片的筛选结果．而且为HBx在致肝细胞癌发生中的作用提供分子基础。     

乙型肝炎病毒X和p53对肝癌细胞生长的影响

目的　探讨乙型肝炎病毒X(HBx)基因与p5 3在损伤情况下的相互作用及对肝癌细胞生长的影响及作用机制。方法　通过构建正义及反义野生型 (wt)p5 3 ,与HBx分别单转染或共转染含wtp5 3 ( + )、HBV( - )的人肝癌细胞株SMMU 772 1细胞 ,在吡柔比星的诱导下 ,用流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响 ,及HBx对细胞周期的影响 ,并通过检测含p5 3结合位点p2 1Waf1启动子荧光素酶活性来观察HBx是否通过p5 3影响p2 1Waf1的表达 ,以及绘制细胞生长曲线观察HBx对SMMU 772 1细胞生长的影响。结果　在吡柔比星的诱导下 ,HBx能够促进细胞凋亡 ,转染空载体组及pcDNA3HBx组细胞凋亡率分别为 5 3 2 %和 12 66%。但HBx对外源性p5 3诱导的细胞的凋亡具有抑制作用 ,转染空载体、正义pcDNA3wtp5 3及正义pcDNA3wtp5 3 +pcDNA3HBx组细胞凋亡率分别为 5 3 2 %、11 72 %、4 67%。同时处在G0 ～G1期瞬时表达及稳定转染HBx细胞数较对照组分别减少 4 79% ,10 2 5 %。而且HBx可抑制p2 1Waf1启动子荧光素酶的活性 (P <0 0 5 )及促进细胞生长。结论　细胞在DNA损伤因素的作用下 ,HBx可能通过抑制p5 3导致p2 1Waf1的表达降低 ,引起停滞在G0 ～G1期的细胞减少 ,导致肿瘤细胞仍能继续分裂增殖形成恶性生长     

两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.

Abstract：

Objective To compare the humoral immune response of BALB/c mice immunized by recombinant plasmids PeDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1.Methods Dengue type 2 virus(DENV2)NS1 gene were constructed two partial sequences(1-413 bp)of the pcDNA3.1 eukaryotic plasmids and pET28a(+)plasmid for prokaryotic expression,identification,purification and quantification.The BALB/c mice were immunized by pcDNA3.1-M-NS1,pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmids with adjuvant.Each animal received a primary inoculation and two boosts at 1-week intervals.Then the blood samples of BALB/c mice were collected from different experiment groups at day 7,14,28 and 56,respectively after first immunization.The specific IgM/IgG antibodies for NS1 protein in serum were confirmed by indirect ELISA.And then the activities of the specific protective antibody were determined by cytopathic effect inhibition(CPEI).Results Construction of the pET28a(+)-NS1 m/pET28a(+)-NS1n prokaryotic expression plasmid,SDS-PAGE analysis showed that,NS1 gene partial sequence was expressed,both the relative molecular weight of about 22.3×103:Western blot showed that the protein can bind anti-His tag monoclonal antibody;byNi affinity chromatographywith apurity of 92% protein,on the C6/36 cell toxicity,and can be used ELASA detection.The results showed that the levels of specific IgM/IgG antibody and neutralizing antibody activities were increased in pcDNA3.1-M-NS1 booster immunization group than other groups.The result had been observed longer duration of antibody level in peDNA3.1-M-NS1 booster immunization group.Conclusion Humoral immune response were significantly different between pcDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmid immunized mice groups.     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。