NOTCH-1信号通路对人脑胶质瘤干细胞增殖和分化作用的研究

目的研究NOTCH-1信号通路对人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的作用及意义。方法应用免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织标本和胶质瘤细胞株中提取、分选胶质瘤干细胞,进行体外培养;应用免疫组织化学、免疫荧光双标法方法和RT-qPCR法分别检测其增殖、分化过程中NOTCH-1信号通路中关键基因和蛋白的表达情况。结果人脑胶质瘤组织中存在胶质干细胞。NOTCH-1在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中均可表达,在CD133阳性细胞中最显著。胶质瘤干细胞增殖过程均能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1、CBF-1和HES-1的mRNA表达,在胶质瘤干细胞分化时,表达逐渐减弱。结论NOTCH-1基因在人脑胶质瘤中高表达;NOTCH-1信号通路参与了胶质瘤干细胞增殖、分化过程,为人脑胶质瘤治疗的新靶点提供了依据。     

恶性胶质瘤细胞在不同培养液和不同时期中CD133阳性细胞比率的变化

目的:观察不同培养液及不同培养时期等因素对体外培养人脑胶质瘤细胞CD133阳性(CD133+)细胞比率的影响.方法:用干细胞培养液(含EGF、FGF-2、B27)培养6例原代胶质瘤细胞和3例对照细胞株,用流式细胞仪检测培养第0、3、7,28、60、90和120天时不同细胞的CD133+细胞比率;免疫组化观察胶质瘤干细胞的多向分化能力;用血清、无血清和干细胞3种培养液分别培养2例长期培养的胶质瘤SHG62、SH066细胞系以及对照的U87和U251细胞株,观察胶质瘤中CD133+细胞在不同培养液中的相互转换.结果:胶质瘤CD133+细胞比率随培养时间推移明显下降(P＜0.05),1周左右均降至＜1%的低水平,而细胞株则比较稳定;干细胞培养液培养的细胞中CD133+细胞比率明显高于血清和无血清培养液培养(P＜0.01);此外,胶质瘤细胞中的干细胞具有多向分化的能力,并且可以在干细胞和血清培养液中互相转换.结论:原代胶质瘤体外培养过程中CD133+细胞比率逐渐下降,而干细胞培养液能明显提高CD133+细胞比率,并且CD133+细胞可以在不同培养液中相互转换.说明生长环境对于细胞比率影响较大,提示可能存在尚未明了的影响干细胞生长分化的相关因子.     

恶性胶质瘤细胞株U251中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从恶性胶质瘤细胞株U251中分离、培养并鉴定肿瘤干细胞。方法:将U251细胞置于含EGF、bFGF、LIF及B27的无血清培养基中培养,形成悬浮生长的细胞球后经免疫磁珠分离获取CD133阳性细胞,采用单细胞克隆法继续在上述培养液中培养。应用细胞免疫荧光染色对肿瘤干细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:在恶性胶质瘤细胞株U251中成功分离出肿瘤干细胞,在上述无血清培养液中呈悬浮生长,具有很强的自我更新与繁殖能力,免疫荧光染色显示该细胞表达CD133,诱导分化后可分化成为神经元与星形胶质细胞。结论:体外培养的恶性胶质瘤细胞株U251中存在脑肿瘤干细胞,并能将其分离、培养及诱导分化。     

人恶性胶质瘤细胞株U251三种克隆的分化特性和胶质瘤干细胞的初步鉴定

目的 观测U251细胞的克隆在形态和分化上的差异,鉴定含胶质瘤于细胞的克隆.方法 克隆形成实验观察U251细胞克隆的形态并分类,免疫细胞化学染色观测不同克隆GFAP和nestin的表达差异.分离低分化克隆,检测其自我更新能力、多向分化潜能及CD133表达情况.结果 U251细胞可形成紧密型、中间型和松散型三种克隆类型.紧密型克隆分化程度最低,此克隆在无血清培养基内形成神经干细胞样细胞球,具有自我更新能力、多向分化潜能,并表达CD133.结论 U251细胞的克隆在形态和分化程度上存在差异,紧密型克隆可能富含胶质瘤干细胞.     

microRNA-613调控CDK14来抑制老年胶质瘤患者瘤细胞的增殖和侵袭作用

目的 探讨microRNA-613调控细胞周期蛋白依赖性激酶14(CDK14)通路来抑制老年胶质瘤患者瘤细胞增殖和侵袭的机制。方法 购自上海北诺生物科技有限公司的人脑胶质瘤细胞株U251共24株,分为shNC组、shmicroRNA-613组、Vector组、microRNA-613组,每组各6株; Western Blotting法和qRT-PCR法检测敲减microRNA-613和过表达microRNA-613后的人脑胶质瘤细胞株U251中CDK14蛋白表达水平,CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室实验验证敲除microRNA-613和过表达microRNA-613后U251细胞的增殖、侵袭能力。结果 人胶质瘤细胞株U251敲减microRNA-613后CDK14蛋白表达增加(P<0.05); 人胶质瘤细胞株U251过表达microRNA-613后CDK14蛋白表达减少(P<0.05); 转染第24、36、48 h microRNA-613组U251细胞增殖率P<0.05); microRNA-613组U251细胞侵袭能力>Vector组,shNC组>shmicroRNA-613组(P<0.05)。结论 microRNA-613可通过调控CDK14信号转导通路来抑制人脑胶质瘤细胞U251增殖、转移。     

Hedgehog信号通路相关基因在人脑胶质瘤干细胞和胶质瘤组织中的表达及其意义

目的探讨Hedgehog信号通路相关基因在人脑胶质瘤干细胞及脑肿瘤组织中的表达及其意义。方法用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测U251和D341恶性脑胶质瘤干细胞中SHH、Ptch、Smo mRNA及23例脑胶质瘤组织中SHH和Smo mRNA的表达。结果 SHH mRNA在U251细胞和胶质瘤组织中的表达分别显著高于其在D341细胞和瘤周组织中表达（P〈0.05）;Ptch mRNA、Smo mRNA在两个细胞系细胞中的表达及Smo mRNA在胶质瘤组织和瘤周组织中的表达无显著性差异（P〉0.05）。结论本结果提示,Hedgehog信号通路的异常启动参与了脑胶质瘤的病理发生、发展过程。     

人脑胶质瘤干／祖细胞系SU-2放射耐受及其相关机制的初步研究

目的研究胶质瘤干细胞在胶质瘤耐受放射中的作用,为克服恶性胶质瘤放射耐受寻找新的干预靶点。方法干细胞培养条件下培养自建人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2,以及人脑胶质瘤细胞系U251和SHG-44,观察不同剂量直线加速器照射前后细胞形态变化、Hoechst 33342-细胞和CD133 细胞比例、肿瘤细胞存活率和裸小鼠致瘤率等项指标,并以实时荧光定量PCR方法检测人脑胶质瘤细胞系U251和人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2照射前后MGMT基因表达水平。结果当照射剂量为1～15Gy时,人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2中的Hoechst 33342-细胞和CD133 细胞比例明显增加,高达18.73%和13.70%,细胞存活率升高、致瘤率(8/8)增加、侵袭性增强,MGMT基因表达水平轻度升高。结论经一定剂量的X线照射后,胶质瘤干细胞因具有强于其他肿瘤细胞的放射耐受性而出现选择性存活且细胞比例升高,其生物学特性如细胞存活率、体内致瘤率增加,侵袭性增强。可能与胶质瘤干细胞DNA损伤修复能力提高有关,确切的分子学机制值得进一步深入研究。     

柯里拉京对胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖活性影响初探

目的从胶质瘤U251细胞中分离肿瘤干细胞并探讨柯里拉京对胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖活性和细胞周期的影响。方法使用免疫磁珠法联合无血清培养法分离肿瘤干细胞,50μg/ml柯里拉京分别干预U251细胞及U251干细胞12 h、24 h,CCK-8检测干预后细胞存活率改变,流式细胞术检测细胞周期变化,倒置显微镜观察干预前后细胞的形态学变化。结果胶质瘤U251细胞中含有少量CD133+细胞,在无血清培养基中呈悬浮、球形生长,具有典型的干细胞特性,在有血清培养基中能够自我分化为胶质瘤细胞;柯里拉京可明显抑制胶质瘤U251细胞及其干细胞的增殖,且对胶质瘤干细胞的抑制作用强于胶质瘤细胞(P0.05);柯里拉京可使胶质瘤U251细胞停留在G2/M期,使U251干细胞停留在S期(P0.05)。结论胶质瘤U251细胞中含有少量肿瘤干细胞;柯里拉京可抑制胶质瘤细胞及其干细胞的增殖,影响细胞周期,但其对U251细胞及其干细胞的细胞周期影响不一,机制可能存在差异。     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

表皮生长因子受体拮抗剂靶向抑制胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂-吉非替尼对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用,为胶质瘤干细胞靶向治疗研究作准备。方法荧光定量PCR检测人脑胶质瘤细胞U251、GBM、SHG44及神经干细胞、脑肿瘤干细胞中EG-FR基因的表达。选择不同浓度的吉非替尼作用于U251细胞48h,MTT法检测药物对细胞的抑制率;流式细胞仪分析吉非替尼作用U251细胞后细胞增殖周期和细胞凋亡比率的变化。结果U251和脑肿瘤干细胞中都高表达EGFR。吉非替尼对U251细胞有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,IC50为19.0μM。以12.7μM、19.0μM和25.3μM吉非替尼处理U251细胞,随着药物浓度的增加,G0-G1期细胞比例和细胞凋亡率都逐渐升高。结论EGFR在U251细胞和脑肿瘤干细胞中都高表达,其拮抗剂吉非替尼对U251的细胞增殖有显著的抑制作用,为靶向治疗胶质瘤干细胞的研究开拓了思路。     

Screening of differentially expressed genes related to differentiation and proliferation by gene expression profiling of different grade astrocytoma cell lines*☆

BACKGROUND： The detection of differential gene expression in brain is possible by cDNA microarray technology, and the screening of differentially expressed genes might provide a biological basis for gene-targeted therapy for tumors. OBJECTIVE： To detect the differential expression of genes among astrocytoma SHG-44 （WHO grade Ⅳ）, CHG-5 （WHO grade Ⅱ）, and ATRA-treated SHG-44 cell lines by cDNA microarray. DESIGN： Laboratory experiments in vitro. SETTING： Department of Neurobiology, the Third Military Medical University. MATERIALS： The experiment was performed at the Department of Neurobiology in the Third Military Medical University of the Chinese PLA from January to October 2007. The SHG-44 cell line （WHO grade Ⅳ） was established by Prof. Ziwei Du, and the CHG-5 cell line （WHO grade Ⅱ） was set up by Prof. Xiuwu Bian from the Third Military Medical University of the Chinese PLA. The cDNA microarray containing 9182 known genes was prepared and provided by Dr. Yang Zhong at the City University of Hong Kong. METHODS： To screen differentially expressed genes from the gene expression profiles detected by cDNA microarray comparisons were made between CHG-5 and SHG-44 cells and between SHG-44 cells with or without treatment with 10 μmol/L ATRA. Some differentially expressed genes were selected randomly for Northern Blot analysis to confirm the results of the microarray. The determination criteria for differential gene expression were as follows. ① The ratio of Cy5 signal to Cy3 was greater than 2.0 or less than 0.5. ② The results of the triplicate microarray hybridizations showed the same trend in three experiments. ③ A gene appeared at least two times on the triplicate microarray hybridizations, and the 3^rd value did not show a contradictory trend. A normalized ratio of Cy5 intensity to Cy3 greater than 2.0 or less than 0.5 was considered to represent up-regulated or down-regulated gene expression, respectively. MAIN OUTCOME MEASURES： The identification of genes that were sim     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。     

U251细胞系来源的脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物模型的建立

目的 从U251细胞系中分离脑肿瘤干细胞并以其为移植物建立动物模型.方法 应用悬浮培养法获得脑肿瘤干细胞,用免疫磁珠分选法分离CD133阳性和阴性细胞;将上述3种细胞植入裸鼠颅内.取移植组织切片观察及进行再培养.结果 免疫磁珠分离技术可获得CD133阳性细胞.悬浮培养法所得的细胞和CD133阳性及阴性细胞进行裸鼠原位移植的成瘤率分别为71.4％、80％和0％.结论 U251细胞系中存在脑肿瘤干细胞.裸鼠颅内注射移植脑肿瘤干细胞能够建立肿瘤模型.     

基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4对人骨髓间充质干细胞向

背景：近年研究发现移植的骨髓间充质干细胞能向颅内创伤、脑卒中、炎症和变性疾病等病灶部位迁移,进而发挥治疗作用,但对于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：探讨基质细胞衍生因子1及其受体 CXCR4在移植的骨髓间充质干细胞趋向缺血脑组织迁移中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行。 材料：骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15~40岁正常或原发病未累及骨髓患者,三四月龄健康雄性SD大鼠72只由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化、体外培养人骨髓间充质干细胞。54只大鼠参照Nagasawa线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,剩余18只作为假手术组,仅插入线栓10 mm。模型组及假手术组大鼠各取9只,分别于造模后第2,4,8天,采用Real-time PCR和免疫组织化学法定量分析缺血脑组织基质细胞衍生因子1表达变化。剩余36只脑缺血再灌注模型鼠随机分为细胞移植组、溶液对照组,18只/组,于再灌注后24 h分别从尾静脉缓慢注入1 mL人骨髓间充质干细胞悬液(含2×109 L-1个细胞)或1 mL PBS。 主要观察指标：人骨髓间充质干细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达,缺血再灌注后脑组织基质细胞衍生因子1 mRNA和蛋白表达变化,免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞向缺血脑组织的迁移和分布。 结果：RT-PCR结果发现人骨髓间充质干细胞表达CXCR4 mRNA,免疫细胞化学染色发现CXCR4主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆。脑缺血再灌注损伤后2,4,8 d,趋化因子基质细胞衍生因子1 mRNA水平呈上升趋势,与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。经静脉移植的人骨髓间充质干细胞定向迁移到脑损伤区域,并大量分布于基质细胞衍生因子1高表达的缺血半暗区,损伤侧大脑半球人骨髓间充质干细胞数量显著高于对侧半球(P < 0.01)。 结论：基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4参与并促进人骨髓间充质干细胞向脑缺血再灌注损伤区的迁移。     

Interleukin-2 expression and glioma cell proliferation following Vaceinia vector gene transfection in vivo

BACKGROUND: The effectiveness of gene therapy is closely related to the efficiency of vector transfection and expression.OBJECTIVE: This study was designed to transfect a human brain glioma cell line with recombinant Vaccinia virus expressing the interleukin-2 (rVV-IL-2) gene, and to observe IL-2 expression and glioma cell proliferation potential after transfection. DESIGN: Experimental observation. SETTING: Department of Neurosurgery, Shenyang Military Area Command of Chinese PLA. MATERIALS: The rVV-IL-2 vectors were obtained through homologous recombination and screening in the Second Military Medical University of Chinese PLA. The human brain glioma cell line and IL-2-dependent cells were produced by the Second Military Medical University of Chinese PLA. Human IL-2 was produced by Genzyme Corporation. MAIN OUTCOME MEASURES: IL-2 expression at different time points after transfection of human brain glioma cells with varying MOI of Vaccinia viral vectors; in vitro proliferation capacity of human brain glioma cells among the 4 groups. RESULTS: IL-2 expression was detectable 4 hours after Vaccinia viral vector transfection and reached 300 kU/L by 8 hours. There was no significant difference in the proliferating rate of human brain glioma cells among the 4 groups (P > 0.05).CONCLUSION: Vaccinia viral vectors can transfect human brain glioma cells in vitro and express high levels of IL-2. Vaccinia virus and high IL-2 expression do not influence the proliferation rate of human brain glioma cells in vitro.