成人脂肪干细胞分离培养与鉴定

目的探讨成人皮下脂肪组织提取脂肪干细胞(ADSCs)的可能性。方法取健康成年人皮下脂肪组织,经酶消化法获得含有ADSCs的细胞悬液,差速贴壁法分离ADSCs、红细胞及少量脂肪细胞。体外培养第3代,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法检测CD29、CD44、CD34及CD106,脂肪细胞诱导分化后进行油红O染色。结果倒置显微镜下观察原代培养细胞呈长梭形、漩涡状生长。免疫化学法检测结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达,CD106、CD34阴性表达,说明分离培养的细胞是ADSCs。脂肪细胞诱导后进行油红O染色证明所得细胞具有向成熟脂肪细胞分化的能力。结论成人皮下脂肪组织可作为ADSCs种子来源,并且所得ADSCs具有分化能力。     

成人乳腺干细胞中乳腺癌相关基因表达的研究

目的 探讨成人乳腺干细胞的分子特点。方法 应用RT-PCR和免疫印记杂交方法，检测从乳腺癌旁正常组织中分离培养的具有乳腺干细胞特点的乳腺上皮细胞（SHMEc）及同源癌组织中乳腺癌相关基因C-myc，C-jun、Ras，C-erbB2的转录和表达。结果 SHMEC不转录癌基因C-myc和c-jun，不表达C-erbB2及Ras癌基因蛋白，而其同源癌组织中可检测出癌基因的转录或表达。结论 成人乳腺干细胞SHMEC，不具有恶性转变的分子基础，有重要的研究价值及临床意义。     

干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的生物学特性

目的探讨干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的相关蛋白表达及生物学特性。方法用干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞,Western blot检测干细胞相关蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期;同时检测干细胞增殖、黏附、耐药及侵袭能力,并摸索结肠癌干细胞最佳冻存条件。结果用干细胞培养基成球培养法成功培养出了结肠癌细胞球,检测发现干细胞相关蛋白表达增强,静止期细胞比例明显升高,细胞增殖速度慢,黏附性、耐药性、侵袭性均强于亲本细胞。结论干细胞培养基成球培养法筛选的细胞球中富集了肿瘤干细胞,为结肠癌干细胞的研究提供了良好的细胞模型。     

肾癌干细胞的培养及鉴定

目的从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。方法将肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（bFGF）的无血清培养基中培养。用流式细胞仪检测其CD133及CD34。收集无血清培养7d后的细胞重新常规培养并观察其分化情况。结果悬浮培养2d后出现肾癌干细胞球,培养7d后表达CD133^＋,CD34^-的细胞占8．33％±1．26％,高于肾癌细胞中表达CD133^＋CD34^-的细胞（P〈0．05）,后者只占1．24％±0．36％。结论用无血清培养基和悬浮培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。     

胎脑神经干细胞的培养及鉴定

检测3个月胎龄人胎脑各个解剖部分神经巢蛋白（Nestin）的表达,分离神经干细胞进行培养,诱导其分化,利用免疫荧光细胞化学技术对培养的神经干细胞及分化细胞进行鉴定.结果 在人胎脑室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮层部位发现数量不等的Nestin阳性表达细胞,从海马和皮层组织分离培养得到的大量悬浮生长具有连续增殖能力的神经干细胞球,能够传代培养,表达神经干细胞的标志物Nestin,经诱导分化为神经元和胶质细胞.     

造血干细胞的生物学特征及其鉴定

造血细胞群中存在着一小部分造血干细胞 ,这些原始的造血干细胞通过分化 ,形成不同系列的造血祖细胞 ,祖细胞不断地增殖并继续分化 ,发育为成熟细胞 ,以维持正常血液细胞群体的稳定 ;同时 ,干细胞在这一增殖分化过程中 ,通过自我更新机制来维持其数量及功能的恒定。因此 ,造血干细胞最基本的特征是自我更新与增殖分化。人类对造血干细胞的认识正逐渐加深 ,检测方法亦不断完善 ,尤其是造血干细胞移植的临床成功 ,更是推动了现代医学的发展 ,但尚需更深入地对造血干细胞的生物学特性进行研究 ,并发展更为准确的检测方法。　　造血干细胞的生物…     

大鼠胚胎期及出生早期乳腺干细胞的免疫组织化学研究

取妊娠20日龄胎鼠及出生后3、8d的SD大鼠乳腺组织标本进行HE染色显微镜下观察,借助抗体SCA-1、CK18和α-SMA,用免疫酶标法和免疫荧光法对细胞进行免疫组化鉴定。结果表明,妊娠第20d鼠胚、出生后3d和8d乳鼠的次级导管上皮中可鉴别出4种细胞表型：SCA-1阳性细胞、CK18阳性细胞、SCA-1和CK18双阳性细胞、SCA-1和？或CK18阴性细胞。根据细胞的形态大小和分布位置,确定SCA-1阳性的小亮细胞为乳腺干细胞。提示大鼠胚胎期及出生早期的乳腺干细胞存在分化潜能;此可为其分离及作为种子细胞转染外源性基因提供实验依据;CK18阳性细胞为已分化的腺上皮细胞,SCA-1和CK18双阳性细胞为已定向的腺上皮祖细胞。     

肝干细胞分离培养条件的筛选

本试验目的是探索明胶和鼠尾胶包被条件对肝干细胞(ＨＳＣ)生长的影响。材料与方法一、材料有进口特级胎牛血清 (ＦＢＳ ,Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,国产新生小牛血清 (ＮＣＳ ,杭州四季青生物工程材料研究所 ) ;ＤＭＥＭ /Ｆ12 (高糖 ,无丙酮酸钠 ,Ｓｉｇｍａ公司 ) ,非必需氨基酸 (× 10 0 ,Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,鼠白血病抑制因子 (ｍＬＩＦ ,Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,肝细胞生长肽 (本所自制 ,0 .5ｍｇ/ｍｌ)和人碱性成纤维细胞生长因子 (ｂＦＧＦ ,10 μｇ ,Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,β 巯基乙醇 ( β ＭＥ ,ＮａｃａｌａｉＴｅｓｏｕｅＩＮＣＫｙ ｏｔａ ,日…     

胃肠道干细胞标记物的筛选

目的研究几种常用干细胞标记物在人胃肠道黏膜干细胞中的表达。方法采用免疫组织化学SP法对5例正常胃黏膜、5例正常小肠黏膜及5例正常降结肠黏膜中Musashi—1、端粒酶逆转录酶（TERT）、Oct-4和Nestin的表达情况进行研究。结果胃黏膜中Musashi—1和TERT阳性细胞主要位于腺体峡部，Oct-4阳性细胞多位于腺体基底部，Nestin阳性细胞主要分布在胃黏膜间质以及腺体颈部。小肠黏膜中Musashi—1和TERT阳性细胞主要在距隐窝底部4～7个细胞的位置，Oct-4阳性细胞散在分布于腺体内，Nestin阳性细胞均分布在小肠黏膜间质，无腺体内着色。降结肠黏膜中Musashi—1和TERT阳性细胞分别主要在距隐窝底部1．4个和1-5个细胞的位置，Oct-4阳性细胞散在分布在腺体内和黏膜间质，Nestin阳性细胞分布黏膜间质内，腺体内无表达。结论Musashi—1和TERT的表达与胃肠道干细胞的位置较吻合，可认为是胃肠道相对特异的干细胞标记物。而Oct-4与Nestin做为胚胎干细胞和神经干细胞的标记物被广泛应用，但不能用于胃肠道干细胞的标记。     

乳腺成体干细胞体内及体外特性的实验研究

目的观察来源于乳腺癌患者的乳腺成体干细胞的体外生长特性。并将其移植到裸鼠体内,研究其体内的发展及变化趋势。方法以免疫磁珠分离乳腺成体干细胞进行体外培养。30只裸鼠,随机分为2组,以胸壁皮下细胞注射法移植入裸鼠体内,并以移植入MCF-7乳腺癌细胞的裸鼠作对照。于术后行大体观察,术后6w行组织学检查。结果乳腺成体干细胞在体外培养可以分化成导管上皮细胞及肌上皮细胞,将其移植裸鼠体内后形成的组织与肿瘤组织有明显差别。在组织切片中可见形成类似乳腺腺管样结构,未形成癌巢组织,并由结缔组织分隔成若干小叶,可见到大量的脂肪组织。结论经免疫磁珠分离的乳腺成体干细胞具有继续增殖及分化的特性,可以诱导裸鼠体内形成类似乳腺样组织,为乳腺形成及发育的研究提供一种新的方法。     

脑胶质瘤干细胞的体外培养与生物学特性观察

目的体外培养人脑胶质瘤干细胞并观察其生物学特性。方法应用无血清培养技术,从手术中获取的人脑胶质瘤组织培养得到肿瘤干细胞,诱导其分化后与原肿瘤组织细胞进行比较。应用细胞免疫荧光技术鉴定肿瘤干细胞表面标志物。结果分别在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD 133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞,能够自我更新增殖、诱导分化、表达干细胞标志物CD 133。为探讨脑胶质瘤的发病机制奠定了基础。     

小肠干细胞与其微环境

人类和啮齿类动物的小肠上皮终生更新不断，这种更新是由位于小肠隐窝底部的多潜能干细胞驱动的。小肠上皮细胞的凋亡脱落及受损坏死与干细胞增殖、分化之间的动态平衡，在维持肠道屏障结构和功能的完整以及损伤后的修复中扮演着重要角色。小肠上皮是单层柱状上皮结构，在人类、小鼠和大鼠，肠上皮在从功能上可分为两个不连续的单位——绒毛分化单位和隐窝增殖单位，干细胞增殖、分化移行路线清晰，使之成为研究成体干细胞体内分化机制的良好模型。定位和分析小肠干细胞的生存环境并阐明细胞分化具体的分子机制，将有助于理解环境因素对干细胞生物学性状的影响。本文就小肠干细胞的分化机制与微环境的关系作一综述。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HMSCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。     

人骨髓基质细胞的培养及鉴定

目的:探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法,为基因治疗提供载体细胞.方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人骨髓进行体外培养扩增,用倒置显微镜观察细胞形态学特征并用流式细胞仪鉴定其CD90表达.结果:分离培养的骨髓基质细胞似成纤维状,原代细胞呈集落生长,并可表达CD90,传代后细胞形态较一致,且随着传代次数的增加CD90表达越高,第3代可达94.31%.结论:骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得,随着传代次数增加,纯度越高,该方法是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法.     

小鼠胚胎与成体肝脏中干细胞变化的探讨

目的 依据干细胞生物学特性,探讨从胚胎到成体肝脏内具干细胞特性细胞的变化状况.方法 分离不同胎龄与日龄小鼠肝脏细胞进行体外培养,观察分离获得的细胞数、培养形成的集落数及生长状态,并对集落进行干细胞表面标记物(c-kit、c-Met、Nestin)、肝细胞表面标记物(AFP、ALB)及胆管上皮细胞表面标记物(CK19)的标记.结果 各组分离的细胞经体外培养均有集落形成,肝干细胞的表面标记提示形成的集落具有肝干细胞特性.其中以第15天胚胎肝脏分离所获的细胞数和培养形成的集落数最多、生长状态最好.15 d后观察的各项指标渐减,细胞生长状态渐差.结论 早期胚胎肝脏中大部分是具有干细胞特性的细胞,随胎龄增加,有干细胞特性的细胞逐渐减少,直至出生第5天仅有少数保持未分化状态的细胞存留在肝脏内.     

类风湿关节炎骨髓间充质干细胞的体外培养和一般生物学特性的初步研究

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养、扩增方法,了解其一般生物学特性.方法 采集RA患者的骨髓标本,经密度梯度离心加贴壁法分离、纯化获得其BMSCs,进行体外培养扩增,观察原代和传代细胞的形态和生长状况、免疫表型分析及增殖能力检测,并对BMSCs进行成纤维细胞集落(CFU-F)形成分析.结果 来自RA患者的BMSCs呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CIM5阴性,SH2(CD105)、CD71、CD44阳性,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的BMSCs相当.结论 RA患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSCs,来源于RA患者的BMSCs在体外具有良好的细胞增殖能力,在细胞形态、集落形成能力以及细胞免疫表型方面与正常供者的BMSCs差异无统计学意义.     

Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells

Like mesenchymal stem cells from bone marrow (BM-MSCs), adipose tissue-derived adult stem cells (ADAS cells) can differentiate into several lineages and present therapeutical potential for repairing damaged tissues. The use of allogenic stem cells can enlarge their therapeutical interest, provided that the grafted cells could be tolerated. We investigate here, for the first time, the immunosuppressive properties of ADAS cells compared with the well-characterized immunosuppressive properties of BM-MSCs. ADAS cells did not provoke in vitro alloreactivity of incompatible lymphocytes and, moreover, suppressed mixed lymphocyte reaction (MLR) and lymphocyte proliferative response to mitogens. The impairment of inhibition when ADAS cells and BM-MSCs were separated from lymphocytes by a permeable membrane suggests that cell contact is required for a full inhibitory effect. Hepatocyte growth factor is secreted by both stem cells but, similar to interleukin-10 and transforming growth factor-beta (TGF-beta), the levels of which were undetectable in supernatants of MLR inhibited by ADAS cells or BM-MSCs, it did not seem implicated in the stem cell suppressive effect. These findings support that ADAS cells share immunosuppressive properties with BM-MSCs. Therefore, ADAS cell-based reconstructive therapy could employ allogenic cells and because of their immunosuppressive properties, ADAS cells could be an alternative source to BM-MSCs to treat allogenic conflicts.