CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。     

泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究进展

目前肿瘤的基因治疗越来越成为肿瘤防治研究中的一个活跃领域 ,ＨＳＶ ＴＫ基因是典型的自杀基因 ,现在该基因已被广泛应用于各种肿瘤治疗研究 ,美国等国家正式批准该基因进入临床治疗肿瘤 ,包括脑胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌等 ,其他如肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等也正在研究中。本文就近年来该基因在泌尿系统肿瘤中的应用进展作一简介。1　ＨＳＶ ＴＫ基因简介　　单纯疱疹病毒 胸苷激酶 (ＨＳＶ ＴＫ) /ＧＣＶ(或ＡＣＶ)系统是目前研究最多、进展最快的一种自杀基因系统 ,单纯疱疹病毒(ＨＳＶ)染色体上有编码胸苷激酶的基…     

肿瘤基因治疗的研究进展

基因治疗是指将外源正常基因通过基因转移技术导入靶细胞,纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的的一种生物治疗方法。本文从自杀基因、基因沉默、抑癌基因、免疫基因、抑制血管生成基因等几方面综述了近几年肿瘤基因治疗的研究和发展现状。自杀基因治疗系统包括HSV-tkGCV系统、H19 RNA、hTERT等,HSV-tkGCV系统是自杀基因治疗系统研究最多的一种,TK基因是药敏基因,肿瘤细胞转染该基因后,对前体药物丙氧鸟苷(GCV)或无环鸟苷(ACV)变得敏感而能被杀死。RNA干扰是基因沉默治疗的主要方式,通过沉默肿瘤相关基因IDO2、DUSP6、IGF1R、ORAOV1等基因可以明显抑制肿瘤生长。抑癌基因激活或过表达可以抑制肿瘤生长,p53和PTEN是两个最有意义的抑癌基因,重组腺病毒p53和PTEN可以显著抑制肿瘤生长。免疫基因治疗是将细胞因子或共刺激分子基因导入肿瘤细胞或体细胞内,通过激发或调动机体免疫功能来控制或杀伤肿瘤细胞,常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、NK等,可供选择的目的基因有肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、趋化因子等。抑制血管生成基因可以通过抑制肿瘤新生血管的生成,来阻止肿瘤生长和侵袭,VEGF-Trap、PEDF、ES通过腺病毒导入肿瘤可以显著抑制肿瘤生长。目前肿瘤基因治疗在特异性、安全性和靶向性方面依然存在亟需解决的问题。      

裸鼠体内组织特异性胞嘧啶脱氨酶抗人类肿瘤的基因治疗

目的：研究组织特异性表达的胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因在裸鼠体内对人类大肠癌和肝细胞癌的治疗作用。方法：将ＣＤ基因修饰的大肠癌ＬｏＶｏ细胞移植到裸鼠体内，观察对全身给予５－氟胞嘧啶（５－ＦＣ）的反应，用含ＣＤ基因的重组病毒产生细胞和５－ＦＣ治疗人肝癌裸鼠模型，并用ＰＣＲ法确定体内基因转移效果，骨髓涂片检测体内基因治疗对造血细胞的影响。结果：转ＣＤ基因对ＬｏＶｏ细胞的致瘤性无影响，全身给予５－ＦＣ治疗６     

荷胃癌小鼠自杀基因治疗后宿主免疫功能观察

目的 研究自杀基因疗法是否能诱导肿瘤宿主产免疫应条。方法 将小鼠胃癌细胞株（ＭＦＣ）接种于小鼠背部制作肿瘤模型,以单线疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）和大肠杆菌胞嘧啶脱氧基酶基因（ＣＤ）注射于瘤体内,并于瘤体周围注射ｍＩＬ－２和ｍＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡ及向腹腔内注射前药９－丙氧乌苷（ＧＶＣ）和５－Ｆｃ。治疗第５周取肿瘤消退小鼠的脾细胞测自然杀伤细胞（ＮＫ）和ＬＡＫ活性;第１２周取ＰＢＬ和脾细胞测Ｎ     

FasL配体基因治疗血管损伤后再狭窄的研究进展

血管损伤反应是参与动脉粥样硬化和血管再狭窄形成的共同机制 ,在动物血管再狭窄模型中 ,经历了 4个相互交错的阶段[1] ,即炎性细胞浸润 ,血栓形成 ,血管平滑肌细胞增生 ,最后是基质形成。ＰＴＣＡ术后再狭窄率高达 30 %～ 50 % [2 ,3] ,血管平滑肌细胞 (ＶａｓｌｕｌａｒＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌＶＳＭＣ)增生是主要的病理变化[4 ] ,而细胞凋亡与细胞增生存在密切关系 ,且参与了再狭窄的形成过程[5] 。促细胞凋亡基因Ｆａｓ配体 (ＦａｓｌｉｇａｎｄＦａｓＬ)导入ＶＳＭＣ ,能诱导ＶＳＭＣ细胞凋亡 ,抑制ＶＳＭＣ增生 ,在动物模型…     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

恶性滋养细胞肿瘤化疗患者的临床观察与护理的进展

为寻求提高治疗恶性滋养细胞肿瘤的疗效 ,减少毒性反应 ,我们自 1988年 1月至 2 0 0 2年 5月采用长春新硷 (Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ,ＶＣＲ)、更生霉素 (ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ ,ＡＣＤ)、5 -氟尿嘧啶 (5 -Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ,5 -ＦＵ)、环磷酰胺(Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ,ＣＴＸ)联合用药 (简称ＶＡＦＣ)同步序贯治疗恶性滋养细胞肿瘤 10 2例 ,取得了满意效果 ,现将护理观察总结如下。1　材料与方法1.1　一般资料 :10 2例均为妇科住院病者 ,其中绒毛膜癌 (绒癌 ) 4 3例 (原发性输卵管绒癌 2例 ) ,侵蚀性葡萄胎 (侵葡 )…     

CD44与肿瘤的关系

ＣＤ4 4是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白 ,它是由单一基因所编码的具有高度特异性的单链膜表面糖蛋白的家族 ,可与多种配体结合 ,介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ＥＣＭ)之间的粘附作用 ,发挥广泛的生物学功能 ,在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达[1、2、3 ] 。近年来 ,人们发现ＣＤ4 4标准体 (ＳｔａｎｄａｒｄＩｓｏｆｏｒｍｏｆＣＤ4 4 ,ＣＤ4 4Ｓ)及其拼接变异体 (ＶａｒｉａｎｔＩｓｏｆｏｒｍｏｆＣＤ4 4 ,ＣＤ4 4Ｖ)在肿瘤的发生、发展中起重要作用 ,尤其是ＣＤ4 4Ｖ6和ＣＤ4 4Ｖ3在肿瘤的浸润、转移和…     

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

[目的]观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2 μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响.设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组.空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔.将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk 和CBRH7919/tk-混合,使tk 细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24 h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育J2 h,加入GCV,培养60 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q＜1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用).[结果]空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显著性差异(P＜0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q＞1.15).[结论]HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用.     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。     

三例艾滋病患者的人类免疫缺陷病毒易感基因型分析

近年来的研究表明 ,人类免疫缺陷病毒 (ＨＩＶ)易感基因ＣＣＲ5、ＣＣＲ2和ＳＤＦ1等基因位点的突变可干扰艾滋病的发病进程[1,2 ] 。其中ＣＣＲ5 △ 32基因突变似乎是最重要的因素 ,它的纯合子突变可降低ＨＩＶ传播的危险性 ,杂合子突变可以延缓艾滋病的发病进程 ,ＣＣＲ2 6 4Ｉ和ＳＤＦ1 3′Ａ基因突变也可延缓艾滋病的发病 ;而甘露糖结合蛋白 (ｍａｎｎｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎ ,ＭＢＬ)的纯合子突变则增加个体对ＨＩＶ的易感性。因此 ,有关ＨＩＶ易感基因的研究成为艾滋病领域中的热点课题。我们在以往研究[3 ,4 ] 的基础上…     

GDNF cDNA在神经及非神经细胞系中的表达

研究重组ＧＤＮＦｃＤＮＡ在神经及非神经细胞系中的表达。方法；重组克隆，基因转染及ＲＴ－ＰＣＲ。结果；ＣＶ１及ＳＨ－ＳＹ－５Ｙ细胞中无ＧＤＮＦ内源性表达，转基因后出现ＧＤＮＦ表达条带。ＮＧ１０８－１５细胞有ＧＤＮＦ的内源性表达，转基因后表达条带增强。结论：重组ＧＤＮＦＣＤＮＡ在神经及非神经细胞系中均有较强表达，提示以此制备的工程细胞在Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ‘ｓ病基因治疗中可能具有重要作用。     

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。     

CD44分子对肿瘤转移能力的影响

肿瘤转移是恶性肿瘤细胞特有的生物学行为 ,它是临床治疗恶性肿瘤非常棘手的问题 ,也是病人死亡的主要原因 ,因此是目前肿瘤研究的重点之一。ＣＤ44 (白细胞分化抗原分化群 44 ,ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 44 )是一组重要的多结构多功能细胞表面粘附分子 ,研究发现ＣＤ44尤其是变异体ＣＤ44Ｖ与肿瘤转移有十分密切的关系[1,2 ] ,某些ＣＤ44的异常表达可影响肿瘤细胞的转移能力。1　ＣＤ44基因结构经过近几年的研究 ,ＣＤ44基因结构已基本弄清[1～ 3 ] 。人ＣＤ44基因位于染色体 11ｐ13 区[4 ] ,小鼠的ＣＤ44基因位于…     

甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实 …

目的 采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗。方法 将２．２ｋｂ的重组人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的上游,构建逆转录病毒载体ＬＸ２．２ＣＤ。再以此载体和另一不含ＡＦＰ基因调控元件的逆转录病毒载体ｐＣＤ２分别转染３种肝癌细胞系和１种肺腺癌细胞系,筛选出整合ＣＤ基因的抗Ｇ４１８克隆,并进行细胞生长抑制实验。     

血管内皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体的改进与体内 …

目的 通过构建一种有相对靶向性的基因治疗载体,将外源基因导入新生血管内皮细胞,为开展靶向于肿瘤新生血管的基因治疗奠定基础。方法 根据血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）与ＶＥＧＦ受体结合位点,修改本实验室已有的酸体寡肽ＧＶ１、ＧＶ２氨基酸序列,并合成了基因转移载体系统。用载体包裹外源ＤＮＡ（β－ｇａｌ）,进行体内实验,观察外源基因在体内的分布和不同时间的表达情况。结果 报告基因在心、肺、肝和肾中无明显地表     

腺病毒载体介导的CD自杀基因体外抑瘤效果观察

目的:构建含CD基因的腺病毒载体pAd-CD, 进行肿瘤的自杀基因治疗.方法:分别构建了含CD基因和LacZ基因的重组病毒质粒载体,同质粒pJM17共转染293细胞同源重组后包装为感染性腺病毒颗粒,经滴度测定后,体外分别感染小鼠前胃癌肿瘤细胞MFC.结果:感染Ad-LacZ的细胞可被X-gal染成蓝色,感染Ad-CD的细胞予前药5-FC可见肿瘤细胞杀伤效果明显.结论:腺病毒载体可有效地转CD和LacZ基因进入肿瘤细胞,C D基因作为自杀基因进行体外肿瘤治疗效果明显,本实验构建的新载体及结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了基础.     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗增效作用的病理学研究

【目的】探讨六味地黄丸对小鼠移植性肝癌HSVt-k/GCV自杀基因治疗增效作用的病理学机制。【方法】昆明种小鼠90只,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组(剂量为10 g.kg-1.d-1)、自杀基因治疗组(腹腔注射丙氧鸟苷100 mg.kg-1.d-1)、联合治疗组;选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠荷肝癌模型,以自杀基因疗法联合六味地黄丸进行治疗并观察疗效;对肿瘤组织进行病理学观察和半定量分析;采用免疫组化技术及原位末端标记(TUNEL)技术观察肿瘤细胞增殖核抗原(PCNA)的表达及凋亡情况。【结果】HSVt-k/GCV自杀基因系统联合六味地黄丸治疗较单独应用HSVt-k/GCV系统或六味地黄丸能更显著地抑制肿瘤生长;免疫组化及凋亡TUNEL染色结果表明联合治疗组对肿瘤细胞增殖的抑制及对肿瘤细胞凋亡的诱导作用与模型对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。【结论】六味地黄丸对实验性肝癌的自杀基因治疗具有增效作用,其机制可能与六味地黄丸抑制了自杀基因治疗过程中肿瘤细胞的加速增殖有关,也与协同促进自杀基因治疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关。     

四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建

将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.