实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

poly(A)加尾的实时荧光定量PCR检测血清miR-124a表达及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清微小RNA(miR)-124a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-124aploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,定量血清中miR-124a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-124a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.999),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-124a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-124a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-7方法的建立及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测血清miR-7,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-7ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green Ⅰ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-7的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-7表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在10~3copies/uL至10~6copies/uL范围内有良好的线性关系(r~2=0.995),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-7表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-7的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

血清标本检测miR-29a实时荧光定量PCR方法的建立及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清miR-29a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-29a ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得c DNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-29a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-29a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在10~3copies/μl至10~6copies/μl范围内有良好的线性关系(r~2=0.991),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-29a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-29a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达

摘要：目的：建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。 方法：设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。 结果：建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病（P<0.05）,而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降（P<0.05）。 结论：SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。     

外周血单个核细胞miR-146a和微管相关蛋白1轻链3及红细胞沉降率与类风湿关节炎疾病活动的关系

目的观察类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血单个核细胞miR-146a、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)表达及红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)变化,探讨其与RA疾病活动的关系。方法 RA患者105例为RA组,采用28处关节疾病活动度(disease activity score 28, DAS28)评分评估RA疾病活动度,分为疾病缓解组26例、低活动度组44例、中高活动度组35例。同期体检健康者105例为对照组。RA组于入院次日、对照组于体检日采集空腹静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量,采用魏氏法检测ESR。比较RA组与对照组、不同疾病活动度RA患者外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量及ESR;Pearson相关法分析外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量及ESR与DAS28评分的相关性;绘制RO...     

血清miRNAs在类风湿关节炎患者中的表达及临床意义

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者血清miRNAs(miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-124a-3p)的表达水平及其临床意义。方法收集2016年10月至2018年10月在我院门诊就诊的39例RA患者临床资料、全血及血清样本。全血样本用于检测血沉(ESR),血清样本用于检测类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)和miRNAs核酸。采用SYBR Green实时荧光定量PCR检测RA患者血清miR-146a-5p,miR-155-5p和miR-124a-3p的表达水平。结果 RA患者治疗前血清miR-146a-5p(1.742±1.058)表达水平显著高于HC组(1.045±0.772),且与DAS28评分(r=0.836 5,P=0.004 5)、ESR值(r=0.437 2,P=0.032 5)和RF含量(r=0.733 6,P=0.013 7)呈正相关;而miR-155-5p(U=42.00,P=0.032 9)和miR-124a-3p(U=44.5,P=0.044 5)表达水平显著低于HC组,且miR-155-5p表达水平与RF含量呈负相关(r=-0.445 3,P=0.031 6),miR-124a-3p表达水平与DAS28评分(r=-0.538 7,P=0.025 8)和RF含量(r=-0.436 5,P=0.046 3)呈负相关;RA患者治疗后血清miR-146a-5p表达水平较治疗前显著下降(U=60.00,P=0.003 8),miR-155-5p(U=64.00,P=0.005 9)和miR-124a-3p(U=85.00,P=0.042 2)表达水平较治疗前显著升高。结论 RA患者血清miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-124a-3p的表达水平异常,对RA患者的诊断具有潜在的临床应用价值。     

乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检出限范围为5×10~2copies/ml~5×10~8copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论 SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

类风湿关节炎患者血清IL-35的水平及其与疾病活动度的关系

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者血清IL-35表达水平与疾病活动度的相关性。方法选取确诊RA患者118例,分为活动期组62例和缓解期组56例。同时选取90例健康人作为对照,ELISA法检测RA患者及对照者血清IL-35水平,实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)中IL-35亚基EBI3和P35 mRNA表达水平。分析血清IL-35水平与DAS28评分、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子(RF)、关节肿胀数(SJC)和关节压痛数(TJC)等的相关性。结果活动期组RA患者血清中IL-35浓度(38.09±16.90)pg/m L显著低于对照组[(82.25±15.82)pg/m L,P0.01)]和缓解期组[(72.96±11.74)pg/m L,P0.01)];依据DAS28评分将活动期组RA患者分为轻度、中度和重度组,血清IL-35水平(pg/m L)在3组中依次降低(轻度60.95±7.31,中度39.68±9.51,重度28.02±9.16),轻度组与中度或重度组间差异具有统计学意义(P0.05)。活动期组和缓解期组患者血清IL-35水平与SJC、CRP和DAS28评分呈负相关性(P0.05),与ESR、TJC、RF无相关性。PBMC中P35 mRNA在RA活动期组中显著降低,低于健康对照组和缓解期组(0.47±0.18 vs 1.91±1.121.82±0.53,P0.01),但EBI3 mRNA在活动期组(1.62±0.68)、缓解期组(1.48±0.77)及对照组(1.86±1.21)中差异无统计学意义(P0.05)。结论活动期组RA患者血清IL-35水平显著下降,且伴随P35 mRNA水平下降,并与RA疾病活动度密切相关,可作为RA疾病活动度评价的潜在指标。     

miR-27a、miR-146a在骨性关节炎患者滑膜组织中的表达及临床意义

目的:检测骨性关节炎(OA)患者与非OA患者滑膜中miR-146a和miR-27a的表达情况,并探讨其与该疾病的相关性。方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应检测46例滑膜组织(OA患者23例,非OA患者23例)中miR-27a和miR-146a的相对表达量。结果:miR-27a和miR-146a在所有的滑膜组织中均能检测到,根据qRT-PC原理,ΔCt值越高其目的基因在相应组织中的表达水平越低,即OA患者滑膜组织的miR-27a和miR-146a的表达水平较对照组呈低表达趋势(P<0.05)。结论:miR-27a和miR-146a的差异性表达与OA滑膜病理变化有关,可能调控uPA的表达促进OA的发展。     

荧光定量PCR检测血清微小RNA-21方法的建立及对乳腺癌诊断的初步应用

目的 建立一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,并初步探讨其对乳腺癌诊断的应用价值.方法 用Trizol试剂提取血清总RNA.用茎环引物将miR-16(作为miR-21内参基因)与miR-21分别逆转录成相应cDNA.再用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR对cDNA进行扩增、检测.然后,通过信噪比(signal to noise ratio,SNR)分析试验的准确性;通过熔解曲线评价试验的特异性;通过标准曲线的R2评估试验的精确性;通过批内和批间差异计算试验的稳定性.另外,用自建方法检测33例乳腺癌患者、18例乳腺良性疾病和49名健康人群血清miR-21和miR-16水平,并根据乳腺癌组与健康对照组中miR-21相对表达量确定临界值,以评价其对乳腺癌诊断的敏感度、特异度.结果 通过PCR退火与延伸在温度和时间上的优化,本试验所建立方法SNR≥99.36％;熔解曲线为单峰;标准曲线R3=0.994 8;批内CV＜ 1.5％,批间CV＜ 4％.以miR-16为内参,用自建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳腺癌组、良性疾病组与健康对照组血清miR-21的相对表达量分别为20.83±18.18、20.86±10.11和9.33±4.44,经Kruskal Wallis检验,3组间表达量差异有统计学意义(x2=16.92,P＜0.001),且健康对照组与乳腺癌组、健康对照组与良性疾病组间的差异均有统计学意义(Z值分别为-2.58、-4.42,P均≤0.01),而乳腺癌组与良性疾病组血清miR-21表达量差异无统计学意义(Z=-0.51,P=0.608).以miR-21相对表达量18.32为临界值,其对乳腺癌诊断的敏感度为51.5％(17/33),特异度为93.9％(46/49).结论 建立了一种较敏感、特异、稳定的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,该方法对乳腺癌的诊断可能有一定价值.     

乙型肝炎病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法 根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I实时荧光定量PCR检出限范围为5×10²copies/ml～5×10⁸copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

类风湿关节炎患者关节液中miRNA表达谱研究及其临床意义

目的检测类风湿关节炎(RA)患者与健康对照者关节液中miRNA表达谱差异及临床意义。方法应用miRNA芯片技术检测3例RA患者和3例正常人关节液中miRNAs表达情况,筛选出表达差异显著的miRNAs,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。进一步研究候选miRNA与RA临床和实验室指标的相关性。结果 RA患者关节液miRNA表达谱中23个miRNA较健康对照者发生显著改变。qRT-PCR检测结果与芯片结果相符。RA患者与健康对照者关节液中miR-146a的表达差异最为显著。Pearson相关分析显示,RA患者关节液中miR-146a的表达与类风湿因子(RF)和DAS28评分呈正相关。ROC曲线分析结果显示,miR-146a曲线下面积(AUC)为0.71,关节液miR-146a预测RA的灵敏度为85.29%,特异度为61.54%。结论 RA患者关节液与健康人关节液存在表达差异显著的miRNAs。miR-146a在RA患者关节液中表达显著升高,其水平与RA的临床和实验室指标存在显著相关性。     

三阴性乳腺癌患者血清miR-146a，miRlet-7a水平表达与临床病理特征和化疗疗效的相关性研究

目的　探究三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)患者血清miR-146a和miR let-7a水平表达与临床病理特征和化疗疗效的相关性。方法　选择陕西中医药大学附属医院2014年7月～2016年6月行乳腺癌根治术并经免疫组化(immunohistochemical, IHC)检测证实为TNBC的79例患者为研究对象。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测血清miR-146a和miR let-7a的水平。相关性采用Spearman秩相关分析。结果　血清miR-146a和miR let-7a在肿瘤直径≥3 cm,临床分期III期和淋巴结转移的患者中的表达水平高于肿瘤直径＜3 cm者,临床分期I~II期和无淋巴结转移的患者,差异具有统计学意义(t=7.41~10.39,均P＜0.05)。TNBC患者化疗后血清miR-146a和miR let-7a表达水平(0.81±0.32和0.60±0.26)显著低于化疗前(1.77±0.51和1.92±0.77),差异具有统计学意义(t=11.31,10.11,均P=0.00)。疾病控制组患者血清miR-146a和miR let-7a表达水平(0.37±0.12和0.51±0.17)低于疾病进展组(1.40±0.79和1.62±0.55),差异具有统计学意义(t=8.97,10.22,均P＜0.05)。Spearman秩相关分析显示血清miR-146a和miR let-7a表达水平与化疗疗效呈负相关(r=-0.199,-0.150,均P＜0.01)。结论　血清miR-146a和miR let-7a表达水平与肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移和化疗疗效相关。     

重症肌无力患者外周血单个核细胞中miR-146a表达分析

目的探讨miR-146a在重症肌无力(myasthenia gravis, MG)患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义。方法 MG患者35例为观察组,同期体检健康者30例为对照组,采用Ficoll分层液法分离外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR法检测2组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量;Pearson法分析MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分的相关性。结果观察组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(3.41±0.25)明显高于对照组(0.95±0.12)(P0.05);全身型MG患者外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(4.18±0.21)高于眼肌型者(3.01±0.15)(P0.05);MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分呈正相关(r=0.584,P0.001)。结论 MG患者外周血单个核细胞miR-146a表达明显上调,且与病情严重程度有关。     

RA患者外周血DcR3表达水平与疾病活动性相关分析

目的探讨DcR3在类风湿性关节炎(RA)发病过程中表达水平的变化及其与疾病活动性关系.方法选择39例RA患者为实验组,26例健康体检者为对照组,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测RA患者外周血单个核细胞DcR3mRNA的基因表达水平,采用 ELISA法检测患者血清中DcR3、IL-4和IFN-γ水平,并将检测结果与DAS28评分进行相关性分析.结果活动期RA患者PBMC中DcR3mRNA表达水平高于缓解期RA患者和健康对照组,差异有显著性(P<0.05);活动期RA患者血清DcR3和IFN-γ水平显著高于缓解期RA患者和健康对照组(P均<0.01);IFN-γ/IL-4比值显示,活动期RA患者显著高于健康对照组和缓解期RA患者(P均<0.01);RA患者外周血DcR3mRNA水平和血清IFN-γ/IL-4比值与DAS28评分呈显著正相关趋势.结论活动期RA患者外周血DcR3蛋白与PBMC中DcR3mRNA表达水平显著升高,可能通过促Th2等作用参与RA的发生发展,与疾病的活动性密切相关.     

实时荧光定量PCR检测脂多糖对NR8383细胞TNF-α mRNA的影响

目的实时荧光定量PCR检测脂多糖(LPS)诱导NR8383肺泡巨噬细胞前后TNF-αmRNA的表达情况。方法体外培养的肺泡巨噬细胞系NR8383分成LPS刺激组和PBS(磷酸盐缓冲液)对照组,LPS终浓度为1μg.mL-1,共培养2 h后,TRIzol法提取细胞总RNA,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测细胞TNF-αmR-N     

血清miR-146a-3p、miR-155-5p表达水平在类风湿关节炎诊疗中的临床应用研究

目的探讨血清miR-146a-3p、miR-155-5p表达水平在类风湿关节炎(RA)诊疗中的应用价值。方法选用RA确诊病例46例(RA组,又分为高度活动组24例、低度活动组22例),健康对照20例作为对照组,采用qPCR SYBR GREENⅠ嵌合荧光染料法,以U6为内参,检测RA组和对照组血清miR-146a-3p、miR-125a-3p表达水平,分析其与RA诊断和疾病活动度的相关性。结果 RA组miR-146a-3p表达水平[0.015(0.005,0.055)]与对照组[0.001(0.001,0.002)]比较,差异具有统计学意义(P=0.001);RA组血清miR-155-5表达[0.039(0.020,0.079)]与对照组水平[0.008(0.005,0.016)]比较,差异具有统计学意义(P=0.001)。RA高度活动组血清miR-146a-3p表达[0.055(0.028,0.138)]与低度活动组水平[0.006(0.003,0.007)]比较,差异具有统计学意义(P=0.001);miR-155-5p表达[0.070(0.055,0.145)]与低度活动组水平[0.024(0.014,0.033)]比较,差异具有统计学意义(P=0.001)。结论 RA患者血清miR-146a-3p、miR-155-5p表达水平明显高于对照组,RA高度活动组血清miR-146a-3p、miR-155-5p表达水平高于低度活动组患者,可认为检测两种miRNA血清表达水平可作为RA诊断和活动度观察指标。     

血清microRNA-141在结肠癌中的表达和临床意义

目的探讨microRNA-141(miR-141)在结肠癌患者血清中的表达及意义。方法用荧光定量PCR(SYBR Green法)检测60例结肠癌患者和60例健康对照组血清中miR-141的表达。结果 miR-141在结肠癌患者血清中的相对表达量为3.29±0.52,与健康对照组的1.02±0.23相比,显著升高(t=11.34,P0.05);随着结肠癌分化程度的降低,血清miR-141的表达增高;血清miR-141在淋巴结转移组的相对表达量为4.45±0.32,在无淋巴结转移组为2.39±0.23,差异有统计学意义(t=2.34,P0.05);结肠癌术后血清miR-141表达明显下降(t=8.53,P0.01)。结论 miR-141在结肠癌血清中高表达,且与结肠癌分化程度和淋巴结有无转移有关。有望作为一种新的生物标志物用于结肠癌辅助诊断。     

外周血检测miR-21方法的建立及在支气管哮喘中的应用

目的设计茎环结构引物,建立外周血检测微小RNA-21(miR-21)的检测方法,并初步应用于支气管哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)样本的检测。方法设计miR-21的茎环结构反转录引物和聚合酶链反应(PCR)扩增引物,以U6为内参照,利用SYBR green实时荧光PCR检测20例支气管哮喘患者和20名健康人的外周血miR-21的表达水平,并分析2组间的差异。结果 SYBR green实时荧光PCR检测U6和miR-21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在外周血中20例哮喘患者的miR-21水平明显高于20名健康人(P<0.001)。结论本实验成功建立了SYBR green荧光定量PCR检测外周血miR-21表达水平的技术平台,为miR-21在支气管哮喘发生中分子生物学机制研究建立了基础。