日本血吸虫重组32kD抗原的纯化和诊断应用

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结合电渗洗脱的方法分离，纯化日本血吸虫重组３２ｋＤ抗原；用酶联免疫印迹技术分析纯化抗原的免疫活性。用纯化抗原，日本血吸虫成虫抗原和可溶性虫卵抗原分别检测慢性血吸虫病人肺吸虫病，肝吸虫病人，钩虫和健康人血清抗体。     

血吸虫14-3-3蛋白的免疫定位和功能

血吸虫病是一种遍及世界70多个国家、累及2亿多人口的地方性流行病，在我国约76万人受累。病原体为具有复杂生活史的血吸虫，其常见有6种，主要流行的是日本血吸虫(Sj)、曼氏血吸虫(Sm)及埃及血虫(Sh)，具有两个宿主，即人和淡水螺类。血吸虫的尾蚴穿透人的皮肤脱     

日本血吸虫14-3-3蛋白质编码基因在原核细胞中的表达

目的 :为了寻找日本血吸虫病新的诊断和候选疫苗分子 ,克隆日本血吸虫 14 -3 -3蛋白质编码基因 ,并进行表达。方法 :提取日本血吸虫成虫RNA ,设计合成引物 ,用RT -PCR法扩增出日本血吸虫 14 -3 -3抗原 (Sj14 -3 -3 )基因编码序列 ,将其克隆入pGEM -T载体 ,然后在真核表达载体 pBKCMV中亚克隆 ,用IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE观察表达结果。结果 :RT -PCR法扩增出一条大小约 765bp的特异性片断 ,克隆质粒pGEM -Sj14 -3 -3和真核表达质粒pBKCMV经双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,诱导表达后 ,经SDS -PAGE可见一条约 3 2 5kDa大小的融合蛋白条带。结论 :本实验成功地克隆了日本血吸虫 14 -3 -3抗原的编码基因 ,并在原核细胞中进行表达 ,为进一步的免疫诊断和核酸疫苗研究奠定了基础。     

血吸虫14-3-3蛋白疫苗的研究现状

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区.采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域,本文综述了血吸虫14-3-3的蛋白质疫苗、DNA疫苗、rBCG疫苗、重组酵母疫苗和Bm-sj14疫苗等方面的研究现状.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的免疫诊断价值评估

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3（rSj14-3-3）间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA法，比较其与可溶性虫卵抗原（SEA）ELISA和间接血凝试验（IHA）检测急慢性日本血吸虫病患者的阳性率及其它寄生虫患者和正常人血清的交叉反应。结果rSj14-3-3-ELISA、SEA-ELISA和IHA3种方法的敏感性分别为90．8％、94．2％和90．0％，特异性分别为87．0％，84．8％和84．8％，差异无显著性（P〉0．05）。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法具有可用于日本血吸虫病免疫诊断的价值。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值

目的 探讨纯化的日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白14—3—3(rSjl4—3—3)诊断血吸虫病的价值。方法 利用纯化的rSjl4—3—3抗原与成虫抗原，间接EUSA法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清。结果 急、慢性血吸虫患者血清rSjl4—3—3抗体检出率为100％和92．0％，与正常人血清未出现交叉反应；抗AWA抗体检出率为98．0％和94．0％，与正常人有7．3％的交叉反应。结论 rSjl4—3—3为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性，具有实用价值。     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫保护作用的研究

目的研究重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫对感染小鼠的免疫保护作用。方法大量制备重组日本血吸虫32kDa蛋白(rSjGST-Sj32)和铁蛋白(GMCSF-SjFer)。48只昆明小鼠随机分为A,B,C,D4组,每组12只。B组和C组分别为rSjGST-Sj32和GMCSF-SjFer免疫组,每鼠注射50μg重组蛋白加弗氏完全佐剂(FCA);D组为联合免疫组,每鼠注射50μg重组32kDa蛋白和50μg铁蛋白的混合物加FCA;A组为FCA对照组。分别于0、2、6w共免疫3次。第3次免疫后2w,每鼠经腹部皮肤攻击感染40±1条尾蚴,感染后第45天剖杀所有小鼠,比较各组间减虫率和鼠肝卵减少率。结果联合免疫组与FCA对照组相比,获得了36.53%的减虫率和68.44%的每条雌虫肝组织产卵减少率,而单独rSjGST-Sj32免疫组的减虫率及每条雌虫肝组织产卵减少率分别为22.80%和43.12%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001);单独GMCSF-SjFer免疫组分别为21.05%和41.91%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001)。结论rSjGST-Sj32蛋白和GMCSF-SjFer蛋白联合免疫可显著地提高这两种蛋白单独应用时的免疫保护作用。     

重组日本血吸虫副肌球蛋白的表达与纯化

用基因重组技术 ,将日本血吸虫副肌球蛋白 (rSj97)基因亚克隆至表达载体pQE30上。在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫副肌球蛋白在大肠杆菌中得以高效表达。通过快速蛋白质液相色谱仪 (FPLC) ,经TALON柱和离子交换柱两步分离纯化 ,获得大量高纯度的重组日本血吸虫副肌球蛋白 ,为水牛现场试验提供了充足的抗原     

日本血吸虫组分蛋白SjR47的大量纯化,收集和鉴定

从日本血吸虫有感染兔红细胞上分离的ＳｊＲ４７和ＳｊＲ１２两种组分蛋白能诱导宿主产生明显的抗病免疫效应。为大量纯化、收集该两种组分蛋白，我们采用了聚丙酰胺凝胶大柱制备电泳技术，并对该法收集蛋白的纯度及其生物活性进行了鉴定。结果表明：该技术不仅可以使蛋白惧查达到毫克级水平，而且蛋白纯度较高，还可保持较高的天然蛋白生物活性，经透析处理后蛋白生物活性更高，用以免疫家兔后可获得高效价的多克隆抗体，为今后进一     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

14-3-3σ蛋白在人类恶性肿瘤中的研究进展

14-3-3蛋白是高度保守的可溶性酸性蛋白家族,近年的研究表明,它们在细胞有丝分裂、生长、分化、增殖和死亡等过程中起重要的调控作用。其中14-3-3σ主要存在于上皮细胞,具有组织特异性,可以与细胞内多种信号蛋白相互作用,促进DNA损伤后的细胞周期G2期阻滞,调控细胞的生长、分化和增殖等多种生物学功能,在肿瘤发生发展过程中表达异常,可能由p53突变或启动子CpG岛超甲基化引起,与人类恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。该文作者仅就14-3-3σ蛋白在人类恶性肿瘤中的研究进展作一综述。     

重组人类神经元14-3-3zeta信号蛋白的纯化及抗体制备

目的制备抗人脑14-3-3 zeta蛋白(31 ku)的多克隆抗体与单克隆抗体,为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物.方法用纯化的rh14-3-3zeta蛋白免疫家兔,制备抗14-3-3多克隆抗血清;电洗脱、透析纯化rh 14-3-3/β-半乳糖苷酶融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rh 14-3-3 zeta单克隆抗体;测定所得抗体效价及其特异性反应.结果得到大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64;获得 1株能稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,其亚型为IgG1型,该株单抗可与重组14-3-3蛋白发生特异性反应.结论获得了敏感、特异的抗rh 14-3-3 zeta多克隆抗血清及稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,为神经系统退行性疾病提供诊断标记.     

14-3-3β蛋白特性及与卡波肉瘤的关系

酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白)是高度保守的可溶性酸性蛋白家族,它们在细胞有丝分裂、生长、分化、增殖和凋亡等过程中起重要的调控作用。其中14-3-3β蛋白在卡波肉瘤组织中高表达,与其发生、发展相关。本文就14-3-3β蛋白的特性以及与卡波肉瘤的关系予以综述。     

抗Sj14-3-3特异性IgY的制备及其诊断日本血吸虫病循环抗原的价值

目的制备抗重组日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),建立双抗体夹心ELISA诊断体系(IgY-ELISA),探讨用于日本血吸虫病的诊断价值。方法利用Sj14-3-3制备并纯化卵黄抗体IgY和兔多克隆IgG抗体;以IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体建立双抗体夹心ELISA诊断方法,检测72例急性血吸虫病患者、128例慢性血吸虫病患者、132例正常人、42例肺吸虫患者、60例华支睾吸虫患者和46例钩虫感染者血清。探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值。结果成功制备并鉴定了抗Sj14-3-3特异性IgY和IgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为73.6%和48.4%,正常人血清的阴性率为94.7%;与肺吸虫患者、华支睾吸虫患者、钩虫感染者血清的交叉反应分别为7.1%、6.7%、6.5%。结论建立了基于IgY的双抗体夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫病患者血清的检测具有较高的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的辅助诊断。     

蛋白质快速定量法及其在rhZP3纯化中的应用

目的建立层析过程中洗脱峰蛋白质含量的快速定量法.方法利用蛋白质的紫外吸收原理和层析软件的积分功能,即A280和峰面积计算层析过程中洗脱峰蛋白质含量.结果洗脱峰大小与蛋白质含量呈线性关系,洗脱峰蛋白质含量可用方程X＝Y/A进行估算,X为待测蛋白含量(mg),Y为洗脱峰面积(mAU×ml),A为1 g/L待测蛋白在层析系统的紫外吸收值(mAU).将其应用于重组人卵透明带ZP3蛋白(rhZP3)的纯化,用该方程估算的纯化蛋白含量与用Lowry法测定结果相似.结论该法简便、快速、重复性好,具有一定实用价值.     

盐藻14-3-3蛋白基因原核表达条件的优化

目的探讨盐藻14-3-3蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达的条件。方法通过改变诱导剂浓度和诱导时间,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同条件下14-3-3蛋白的表达情况。结果在诱导剂(IPTG)浓度为0.5 mmol.L-1的条件下诱导培养3 h其表达效率最高。结论盐藻14-3-3蛋白在pET原核表达系统中,0.5 mmol.L-1IPTG诱导3 h为其最适表达条件。