人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

依地福新诱导重组Fas基因酵母的凋亡

目的将人Fas基因转染至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,并观察依地福新对重组酵母的促凋亡作用。方法抽提Jurkat细胞的RNA;RT-PCR制备Jurkat细胞的cDNA;PCR扩增人Fas基因;将人Fas基因克隆到pREP3X-HA质粒中构建pREP3X-HA-Fas穿梭载体,电转化穿梭载体到野生型粟酒裂殖酵母细胞中;应用Western blotting鉴定蛋白表达产物;应用依地福新诱导重组酵母产生凋亡应答。结果在33个酵母转化单菌落中,筛选到一个有表达活性的pREP3X-HA-Fas重组子,且依地福新能诱导此重组子的凋亡。结论成功构建pREP3X-HA-Fas穿梭载体并转入到相应的野生型粟酒裂殖酵母细胞中,且转化子具有表达活性。依地福新可能通过Fas诱导酵母细胞凋亡。     

重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆人白细胞介素 18(IL 18)基因 ,构建重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素 18(rhIL 18) ,并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增出成熟肽编码区cDNA(496bp) ,克隆到表达载体pBV2 2 0质粒中 ,Western印迹证实rhIL 18在大肠杆菌DH5α中获得表达。经分子筛层析法初步纯化后 ,用溴化四唑蓝 (MTT)比色法测定复性的rhIL 18的体外活性。结果rhIL 18表达量占总菌体蛋白的 2 7%左右 ,经纯化得到纯度达 96 %以上的rhIL 18。实验显示rhIL 18协同IL 2 (10U/ml)诱导NK细胞细胞毒活性。结论rhIL 18具有较好的生物学功能 ,应予进一步的研究     

重组人可溶性TRAIL在毕赤酵母中表达与纯化及其抗肿瘤细胞活性

目的研究重组人可溶性TRAIL(sTRAIL)蛋白的表达和纯化,以及对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。方法将人sTRAIL基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-sTRAIL,电击转化至GS115(his4),MD平板筛选出阳性菌株。对工程菌株发酵培养基成分、pH、甲醇浓度、诱导表达时间等条件进行优化,并初步分析重组sTRAIL蛋白的体外抗肿瘤活性。结果工程菌株在BMMY培养基(pH6.0)、1%甲醇条件下诱导表达48h目的蛋白浓度最高可达(58.7±2.4)mg/L。重组人sTRAIL蛋白能抑制HepG2细胞的增殖、诱导HepG2细胞的凋亡。结论优化了人sTRAIL的表达和纯化工艺条件,所生产的sTRAIL可用于抗肝癌新药的开发。     

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体与重组L-门冬酰胺酶对小鼠毒性作用比较

为了考查L-门冬酰胺酶(L-Asparaginase,L-ASNase)前体脂质体(Proliposomes)( L-ASNasePL) 与L-ASNase的急性毒性及对外周血中白细胞总数及血小板数的作用.脂质体组小鼠静脉注射给药(L-ASNasePL),给药剂量为给以最大药物浓度(4000KU/m1),最大静脉注射体积(0.5m1/20g);L-ASNase 组给药体积为0.4ml/20g,给药一次,给药后每天观察记录小鼠活动、死亡情况,共观察14d.结果L-ASNasePL 的毒性与L-ASNase 相比明显降低,其小鼠iv的L-ASNasePL的最大耐受量为10.0×105KU/kg,相当于每日人临床拟用剂量的5000倍.对正常小鼠体重、外周血中白细胞总数及血小板数的影响:L-ASNase高剂量组(1000KU/kg)有显著降低小鼠外周血中白细胞总数及血小板数的作用(P<0.05),而L-ASNasePL对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响.L-ASNasePL组及L-ASNase组对小鼠体重增长均无明显影响.说明L-门冬酰胺酶前体脂质体急性毒性明显小于L-门冬酰胺酶,L-ASNasePL对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响.     

重组L-天冬酰胺酶的鉴定

目的 :对重组L 天冬酰胺酶进行鉴定。方法 :用基因测序、氨基酸组成分析、N 末端氨基酸测序、胰肽图谱、IEF、分子量、紫外扫描等各种实验手段对重组L 天冬酰胺酶及其天然品进行了全面比较。结果 :重组产品与天然品具有同质性。结论 :重组L 天冬酰胺酶具有较好的应用前景。     

重组卡介苗的研究与应用

重组卡介苗可同时表达多种病原体抗原，已成为新的疫苗载体。对重组卡介苗的研究方法和进展，包括重组卡介苗疫苗载体、启动子、电转化方法、绿色荧光蛋白的作用、重组耻垢分枝杆菌疫苗及重组卡介苗的作用机制等进行综述，并介绍了重组卡介苗在表达病毒、细菌及寄生虫抗原和表达细胞因子及抗肿瘤等方面的应用。     

Recombinant human interferons

The genes for several human interferons (IFN) alpha, of IFN beta and IFN gamma have been cloned and expressed in bacterial cells. Recombinant interferons have been purified from these cells and shown to be as biologically active as their natural counterparts. The expression systems, purification schemes and the biochemical properties of these interferons are discussed.     

Recombinant Interleukin-2

Recombinant interleukin (IL)-2 is a newly approved immunoregulatory protein produced by lymphocytes that exhibits a wide range of immunologic effects. It is a true biologic response modifier in that is has no known direct antitumor activity, but mediates its cytotoxicity through activation of effector cells including T cells, natural killer cells, and lymphokine-activated killer cells. Recombinant IL-2 has demonstrated activity in patients with renal cell carcinoma and melanoma, with objective response rates of approximately 15–20%. The median duration of response in renal cell carcinoma is 23 months. Toxicity experienced with high-dose IL-2 can be significant. The most common dose-limiting toxicities are hypertension, weight gain, oliguria, respiratory insufficiency, and neurotoxicity. These effects are generally manageable and reversible on discontinuation of therapy. Administration of low-dose IL-2 has emerged as a means of substantially reducing toxicity. At least in renal cell carcinoma, it appears that the response rate to low-dose IL-2 is comparable to that with higher dosages.     

重组人促红细胞生成素与神经疾病

重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoi-etin,rhEPO)目前在临床上主要用于治疗各种原因引起的贫血。大量研究表明,rhEPO除具有造血调节活性以外,还具有强大的神经保护作用。rhEPO对创伤性脑损伤、脑卒中、胎儿和新生儿脑损伤、脊髓损伤、神经病理性疼痛、精神分裂症、视神经损伤等多种神经疾病具有潜在的临床应用前景。该文就近年来rhEPO对以上各种神经疾病作用研究的最新进展进行了全面综述。     

Recombinant TCR Ligand Reverses Clinical Signs and CNS Damage of EAE Induced by Recombinant Human MOG

Increasing evidence suggests that in addition to T cell-dependent effector mechanisms, autoantibodies are also involved in the pathogenesis of MS, including demyelinating antibodies specific for myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). Our previous studies have demonstrated that recombinant T cell receptor ligands (RTLs) are very effective for treating T cell-mediated experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). In order to expand the scope of RTL therapy in MS patients, it was of interest to study RTL treatment of EAE involving a demyelinating antibody component. Therefore, we evaluated the therapeutic effects of RTL551, specific for T cells reactive to mouse (m)MOG-35-55 peptide, on EAE induced with recombinant human (rh)MOG in C57BL/6 mice. We report that RTL551 therapy can reverse disease progression and reduce demyelination and axonal damage induced by rhMOG without suppressing the anti-MOG antibody response. This result suggests that T cell-mediated inflammation and associated blood–brain barrier dysfunction are the central contributors to EAE pathogenesis and that successful regulation of these key players restricts potential damage by demyelinating antibodies. The results of our study lend support for the use of RTL therapy for treatment of MS subjects whose disease includes inflammatory T cells as well as those with an additional antibody component.     

从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).