内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库.方法提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6 h后mRNAs,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因,亚克隆入T/A质粒并转化感受态大肠杆菌.结果成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库,为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础.结论经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因,对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义.     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库的构建与鉴定

研究目的是构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库，以用于白血病多药耐药(MDR)相关基因的筛选。采用改良的消减杂交方法建立急性白血病耐药细胞差异表达基因cDNA文库，提取HL-60／VCR与HL-60细胞mRNA，将HL-60／VCR细胞mRNA用Cap-Finder法反转录成cDNA，与以常规反转录的HL-60细胞cDNA为模板．PCR合成生物素标记的扣除探针进行杂交。杂交产物用Sephacryl S-400柱和具有链亲和素作用的磁殊纯化后，得到差异表达cDNA。PCR法特异扩增，进行T-A克隆建成消减cDNA文库，并通过反向点杂交鉴定其质量。结果表明：构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库所需样本量少且时间短，全长或近全长的cDNA分子较多(约达总数的2／3)，质量较高。结论：成功构建急性白血病多药耐药相关消减cDNA文库，为筛选白血病耐药相关基因奠定了基础。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础。方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成。从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750bp,符合预期的文库构建要求。结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的探测人直肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段,了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法应用抑制性消减杂交技术,获得人直肠腺癌差异表达的基因,用生物信息学cDNA文库筛选的方法,对人直肠腺癌cDNA消减文库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆,提取质粒,双酶切分析,进行序列测定,得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA(Genbank登录号为BM360862),用cDNA文库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析(SAGE)显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论直肠腺癌的发病是多环节和多步骤的过程,9cDNA与直肠腺癌发病相关,对9cDNA基因差异片段进一步研究,将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景：外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。目的：探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。方法：应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Westernblot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。结果与结论：100μg/L脂多糖刺激6h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用LatrunculinB抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景:外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。目的:探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。方法:应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Westernblot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。结果与结论:100μg/L脂多糖刺激6h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用LatrunculinB抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

筛选心肌缺血再灌注大鼠差异表达基因

目的：利用抑制性消减杂交技术，筛选出大鼠心肌缺血再灌注的差异表达基因，以期通过基因线索探讨其损伤机制。方法：实验于2006—03／10在中山大学中山医学院完成。①实验分组：Sprague-Dawley雄性大鼠40只，随机分为手术组，对照组，每组20只。②实验干预：手术组结扎左冠状动脉，心电图出现急性心肌梗死改变90min后，去除结扎线，再灌注60min，建立心肌缺血再灌注大鼠模型。对照组仅穿线不结扎，余同手术组。③取缺血区心肌，提取Total RNA，构建cDNA文库，利用抑制性消减杂交技术筛选差异表达基因，测序，登录Genbank寻找同源性基因。结果：共获得124个阳性结果，56个为高表达基因，68个为低表达基因，其中发现5个新的cDNA片段。其中能量代谢、物质运输、信号转导相关差异表达基因分别占所有差异表达基因的39．25％，15．89％，15．89％，并且主要变化为下调。结论：抑制性消减杂交技术是一种高效的筛选差异基因的方法。心肌缺血再灌注后基因变化涉及多种功能的基因，以能量代谢、物质运输、信号转导相关基因下调明显。     

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞中差异表达的基因，以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”，以源自意外而致流产的孕4—5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”，建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选，并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明：在所构建的AGM抑制消减杂交文库中，经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200—700bp的克隆有211个，阳性率高达76.4％。经过基因芯片筛选，挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示，在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中，4个为未知基因，14个为已知基因，其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论 筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了重要的理论基础。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择2005—08／10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例，另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA，用SMART（Switch Mechanism At 5 end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA，用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果：TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高（A260nm/A280nm。〉1．90），用SMART技术扩增微量RNA，扩增产物双链cDNA主要分布在0．5～10kb，基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段，得到了480个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

利用基因芯片技术研究造血生长因子在脐静脉内皮细胞中的表达

为探讨利用基因芯片技术研究脐静脉内皮细胞中造血生长因子基因的表达情况，将体外培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)分为血管内皮生长因子(VEGF)处理组(添加50ng／ml的rhVEGF165)和正常对照组；培养24小时后收获细胞，提取总RNA，制备Cy3-dUTP标记的对照组cDNA探针和Cy5-dUTP标记的VEGF组cDNA探针，并与表达谱芯片杂交。杂交信号经荧光共聚焦显微镜扫描后，计算机分析基因表达情况。结果显示。两组细胞均表达多种造血生长因子及受体如Epo/R、GM—CSF／R、G—CSF／R、LIF、IL-3、TPO、Fit-3和SCF；同时也表达多种生长因子(VEGF、IGF2、PDGFA、PDGFB、TGFβ1)和生长因子受体(神经纤维黏蛋白-1，神经纤维黏蛋白-2，TGFβ-R1)；此外，共有24个基因存在差异表达。结论：利用基因芯片技术能够在短时间内迅速而准确地分析脐静脉内皮细胞众多造血生长因子及其受体的表达情况，为进一步研究内皮细胞的生物学特性提供了有效手段。     

新生大鼠脊髓损伤后再生相关基因文库构建及EST筛选

目的：分析新生大鼠损伤后再生时运动皮层神经元基因表达变化以探讨相关的再生机制。方法：新生大鼠脊髓双侧半横断后即刻单侧胚胎脊髓移植，术后3天用抑制性消减杂交技术筛选大鼠双侧运动皮层神经元差异表达基因，构建差减cDNA文库，通过蓝白斑实验和cDNA斑点杂交验证差异表达基因真阳性克隆，测序分析。结果：发现25个全新的EST片段，在GenBank中登陆并获得注册。结论：新生大鼠皮层神经元轴突中断后的再生过程中有基因表达变化，变化的基因可能与神经元再生有关。     

白血病原代骨髓基质细胞对柔红霉素作用下Jurkat细胞基因表达的影响

目的研究白血病患者骨髓基质细胞（BMSCs）抑制柔红霉素（DNR）诱导Jurkat细胞凋亡过程中Jurkat细胞相关基因表达的变化,并进一步分析差异表达基因在BMSCs对Jurkat细胞保护过程中的意义.方法采用Percoll体外分离初治急性白血病患者骨髓单个核细胞,贴壁培养BMSCs;采用抑制性消减杂交技术等分子生物学方法建立白血病BMSCs保护的Jurkat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs保护的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;其功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢相关.结论白血病患者BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达,为探讨白血病患者BMSCs保护白血病细胞逃避化疗药物杀伤的分子机制进行了前期研究.     

心肌病大鼠骨髓间充质干细胞移植后差异表达基因cDNA文库的构建

目的：构建心肌病大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌差异表达基因的cDNA文库，为后续的基因测序和信息学分析打下基础。方法：实验于2003—07／2005—03在重庆医科大学儿童医院儿科研究所和解放军第三军医大学野战外科研究所四室完成。实验材料：雌性Wistar大鼠54只，体质量（200＋20）g，由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。实验方法：采用贴壁筛选法分离、扩增、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，选用第三、四代的骨髓间充质于细胞用于移植实验。采用2．5mg／kg阿霉素腹腔注射法建立大鼠心肌病心力衰竭模型。并分为实验组与对照组：实验组于左心室前壁靠心尖处注射骨髓间充质干细胞，对照组注射培养基。采用抑制性消减杂交技术构建骨髓间充质干细胞移植1周后大鼠心肌组织的差减文库。结果：①对照组和实验组移植前左室射血分数与左室缩短分数相比无差异，实验组左室射血分数与左室缩短分数在移植2周时明显高于对照组（P〉0．05，P〉0．01）。②以正向消减产物为模板，在第33个循环才出现明显的G3PGH条带，而在非消减的对照中，第18个循环就能看见明显的条带，二者相差约15个PCR循环，同样在反向消减中二者相差也是15个PCR循环。按抑制性消减杂交方法的要求，只要二者之间相差5个循环以上就表明消减效率很高，可以用于下一步文库构建和筛选。③筛选出骨髓间充质干细胞移植后表达增高的cDNA克隆123个；表达降低的cDNA克隆28个。结论：运用抑制性消减杂交方法成功构建了骨髓间充质干细胞移植后心肌病大鼠的cDNA文库，为下一步研究打下基础。     

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40／CD40L表达的影响

目的：探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响。方法：实验于2004—03／06在中南大学湘雅二医院实验室完成。实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿，产妇知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准。辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供。原代培养人脐静脉内皮细胞，实验在第4代有70％细胞汇合的情况下进行。低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol／L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24h，在准备后15d内用于实验。采用流式细胞技术检测CD40／CD40L在细胞上的表达，采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κBP65 mRNA，同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κBP65的表达。观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40／CD40L分子和NF-κB P65 mRNA的影响实验中，共分5组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③低浓度辛伐他汀组，先予1μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。④高浓度辛伐他汀组，先予10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。⑤单纯辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预25h。免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κBP65分子表达的实验中，共分3组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。结果：①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40／CD40L的表达情况：20-80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h后，CD40／CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加。②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响：预先给予辛伐他汀（1μmol／L和10μmol／L）干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40／CD40L表达，与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较，差异显著（P均〈0．05）；10μmol／L的高浓度辛伐他汀较1μmol／L的低浓度辛伐他汀作用更明显（P〈0．05）；而单纯给予10μLmol／L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L的表达。③辛伐他汀对NF-v：BP65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响：人脐静脉内皮细胞中加入80mg／L氧化低密度脂蛋白培养24h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组（0．53&;#177;0．06，0．08&;#177;0．01，P〈0．01）。而预先给予1μmol／L辛伐他汀孵育lh显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA，明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．31&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01）。高浓度组（10μmol／L）作用更显著，显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．14&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01），而单纯给予辛伐他汀（10μmol／L）不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达。结论：氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L，而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达，可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF—κBP65的表达有关。提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用。     

应用抑制消减杂交研究惊恐致肾虚及金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因

背景：中药金匮肾气丸能改善肾虚症状，但其分子机制还不清楚。 目的：用抑制消减杂交技术观察惊恐致肾虚及中药金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因。 设计：随机对照动物实验。 单位：成都中医药大学中医遗传学研究室，四川大学生命科学学院分子生物学与生物技术四川省重点实验室。 材料：实验在成都中医药大学实验动物中心进行。取BALB／c雄性成年小鼠30只，单纯随机分为模型组、药物治疗组和对照组3组，每组10只小鼠。 方法：模型组和药物治疗组小鼠应用“恐伤肾”法和悬吊应激法制备肾虚鼠模型。药物治疗组小鼠每天灌服金匮肾气丸（北京同仁堂制药厂生产，由桂枝、附子、熟地、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、丹皮等组成）1次，给药剂量按成人用药量的20倍。造模及给药时间总共为14d。对照组小鼠自然生长，不施加任何外界刺激。最后一次给药后24h，3组小鼠均取血100μL，应用SMART技术反转录并扩增以获取各组小鼠血液的全长总cDNA；运用正向和反向抑制消减杂交技术获得正反两个方向、3种状态下（肾虚、治疗后以及正常生理状态）的6组差异表达cDNA片段。主要观察指标：金匮肾气丸对肾虚小鼠基因表达的影响。 结果：①各组均有差异表达的cDNA片段；中药治疗后，肾虚小鼠的差异基因表达谱有向正常生理状态下接近的趋势；用同一种cDNA作为抑制消减杂交的tester和driver，同源片段全部被消减掉，消减效率较高。②获得了6个cDNA文库。 结论：惊恐所致肾虚与一些基因的差异表达相关，而中药金匮肾气丸能影响这种改变，使其差异表达基因谱趋近于正常生理状态。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的 探测人真肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段，了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，获得人直肠癌差异表达的基因，用生物信息学cDNA库筛选的方法，对人直肠腺癌cDNA消减库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果 用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆，提取质粒，双本科切分析，进行序列测定，得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA（Genbank登录号为BM360862），用cDNA库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析（SAGE）显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论 直肠腺癌的发病是多环节和多一步研究，将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础.方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成.从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A) RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库.结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750 bp,符合预期的库构建要求.结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减库,该库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据.     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

肿瘤坏死因子a刺激人脐静脉内皮细胞线粒体偶联因子6表达及其分子机制

背景：线粒体偶联因子6作为一种新的血管活性肽，参与了许多生理功能调节。目的：探讨人脐静脉内皮细胞在肿瘤坏死因子a刺激下线粒体偶联因子6的表达及其分子机制。设计、时间及地点：分组对照观察，实验于2006—06／200703在南方医科大学附属珠江医院完成。材料：健康产妇足月分娩的脐带来源于南方医科大学附属珠江医院产科（产妇均签署知情同意书）：肿瘤坏死因子a为北京邦定泰克生物有限公司产品；鼠抗人线粒体偶联因子6单克隆抗体为美国凤凰药业公司产品。方法：应用肿瘤坏死因子a（100～250μg／L）刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞。主要观察指标：以流式细胞术检测线粒体偶联因子6在细胞膜上的表达，以反转录一聚合酶链反应方法检测线粒体偶联因子6mRNA不同时间的表达变化，以蛋白质印迹分析检测细胞核中NF—KB不同时间的表达变化，同时检测胞浆中IKBa的含量变化。结果：肿瘤坏死因子a刺激人脐静脉血管内皮细胞膜表面线粒体偶联因子6表达增加，线粒体偶联因子6mRNA表达增强，刺激1h后线粒体偶联因子6mRNA表达最强，1．5h后回到原来水平，核内核因子KB含量在6h明显增加，之后一直持续高水平状态，而胞浆中IKBa含量在6h明显减少，之后一直持续低水平状态。结论：肿瘤坏死因子a刺激人脐静脉血管内皮细胞后，迅速活化核因子KB，启动线粒体偶联因子6的转录，线粒体偶联因子6mRNA的表达增加，线粒体偶联因子6合成增加，导致线粒体偶联因子6在细胞膜表面表达增加。