胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５ 中提取总ＲＮＡ ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论：分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表达产物占全菌总蛋白的２４．７％ ,初步纯化后纯度达９０％ 以上。     

两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建

目的 :构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法 :利用PCR技术 ,对已有载体pPIC9K进行改造 :在多克隆位点处增加一个NaeⅠ酶切位点 ;去除卡那霉素抗性基因中的一个XhoⅠ酶切位点。结果和结论 :成功地构建了pMEN9K ,pMEX9K两个载体 ,并可以利用这两个载体对外源基因进行分泌表达     

人脑源性神经营养因子在T_7RNA聚合酶启动子控制下的诱导性表达

人脑源性神经营养因子在Ｔ＿７ＲＮＡ聚合酶启动子控制下的诱导性表达余云开，赵彬，范明，汪家政（军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０）脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）是迄今已明确多肽结...     

人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用

目的：通过巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（ endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ,Endo-H）,并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌（ Strepto-myces plicatus） Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P．pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P．pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可＞95％。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳（ DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis,DSA-FACE）分析核糖核酸酶B（ribonuclease B,RNaseB）的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F（peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F）的糖基切割功能。结果利用P．pastoris表达制备Endo-H,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSA-FACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P．pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。     

胶质源性神经营养因子在人外周血白细胞中的表达

胶质源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)因最初在大鼠胶质细胞系Ｂ49细胞中发现而得名。ＧＤＮＦ显著的生物学功能是能促进多种神经元细胞的生长和分化 ,包括多巴胺能神经元、外周自主性神经元亚群和感觉神经元 ,中枢神经系统的运动神经元 ,去甲肾上腺素能神经元等。ＧＤＮＦ的组织分布比较广泛 ,在发育个体的脑组织包括海马、脑皮层和中脑及外周组织的皮肤、肾脏、胃、精囊、骨骼肌、卵巢、肺、肾上腺有一定程度的表达 ,在心脏、脾、胸腺、甲状腺、垂体和唾液腺检测到极低水平的ＧＤＮＦｍＲＮＡ。成年动物中 ,ＧＤＮＦ在小肠中的表达水平上升 ,…     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脑损伤

目的探索移植转染胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因的大鼠神经干细胞（NSCs）能否促进脑损伤大鼠的神经功能修复。方法利用阳离子脂质体转染GDNF基因到大鼠NSCs，在脑立体定向仪引导下分别将PBS、NSCs、转基因NSCs移植到脑损伤大鼠局部损伤灶边缘，通过观察记录大鼠行为能力的变化，评价移植细胞后大鼠神经功能的修复情况。结果转染后72h，荧光蛋白大量表达。转基因细胞移植后可以在14d时仍表达GDNF基因，各实验组于移植后3d时行为学指标差异无统计学意义（P〉0．05），而在移植后7d，移植转基因NSCs组和NSCs组即与对照组在行为学指标上差异有统计学意义（P〈0．05）；在移植后14d，移植转基因NSCs组与其余两组在行为学指标上差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论转基因NSCs移植后可以分泌GDNF并促进脑外伤大鼠神经功能的恢复。     

硫氧还蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

硫氧还蛋白在毕赤酵母中的分泌表达段聚宝蔡欣王嘉玺周俐梅军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０甲基营养型巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）具有能高密度生长、可有效分泌表达外源基因、分泌表达产物无过度糖基化且易于纯化等特点，但外源蛋白分...     

毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的：通过毕赤酵母（Pichia pastoris）表达制备重组人凝血酶原2（prothrombin-2）,并利用锯鳞蝰（Echis carinatus）凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据GenBank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体pPICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3．1（＋）,瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺（pNA）,且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

长链胰岛素样生长因子1在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

目的:在毕赤酵母KM71中分泌表达长链-Arg3-胰岛素样生长因子1(LR3IGF-1),并探讨其体外生物活性.方法:人工合成LR3IGF-1基因,构建表达载体pCαA-LR3IGF-1,转化毕赤酵母KM71.筛选重组工程菌株,经诱导表达并从上清中纯化目的蛋白,鉴定其生物活性.结果:诱导上清中存在一8×103 左右的条带,经初步鉴定为目的蛋白条带.每升培养基经纯化后能得到40 mg目的蛋白.纯化后的目的蛋白具有明显的体外刺激NIH 3T3细胞增殖的作用.结论:建立了LR3IGF-1在毕赤酵母 KM71中表达及纯化方法,该方法能获得具有生物学活性的高纯度LR3IGF-1,为LR3IGF-1的后续研究及临床应用奠定了基础.     

利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究

目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y（carboxypeptidase Y,CPY）基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。     

重组人血清白蛋白在酵母中的表达及分析鉴定

目的：实现重组人白蛋白（rHSA)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达,方法：将本室构建的rHSA表达载体转化毕赤酵母,用G418筛选抗性克隆,SDS－PAGE与Western印迹检测并鉴定表达产物;采用生化法、电泳扫描及Brodford法、竞争ELISA3种方法测定摇瓶培养条件下rHSA的表达量。结果：Western印迹分析发现转移至膜上的酵母表达产物能与抗人血清白蛋白单克隆抗体结合,相对分子质量与人血白蛋白一致,证明在酵母中成功地表达了rHSA。在甲醇诱导下摇瓶培养,rHSA表达量随诱导表达时间的延长而增加,第8天产量约为3．5g/L。结论：人血清白蛋白表达载体与毕赤酵母基因组整合,获得酵母表达株,摇瓶培养,该株表达量为3．5g/L。     

人脑源性神经营养因子序列的获得及鉴定

 目的 获得人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因并进行序列分析,为基因治疗提供参考.方法 提取胚胎脑组织基因组mRNA,应用RT-PCR技术获得hBDNF基因序列酶切鉴定,并进行序列测定和分析.结果 DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列(AY054406)比较,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744 bp,序列完全相同.结论 hBDNF基因序列的获得,为进一步开展面神经损伤的基因治疗积累了资料.     

长型LRP16基因真核表达载体的构建及在HL60细胞中的表达

目的：构建长型LRP16基因开放阅读框架序列的真核表达载体，并观察其在髓系白血病细胞系HL60细胞中的表达情况。方法：采用RT-PCR方法自1例健康献血员外周血单个核细胞中克隆长型LRP16 cDNA；将长型LRP16 cDNA克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定；将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3．1( )，构建真核表达载体pcDNA-LLRP16；脂质体介导法将其转染m60细胞，培养72h后用RT-PCR方法检测转染细胞中长型LRP16基因的表达情况。结果与结论：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人长型LRP16基因序列；转染实验表明LRP16基因能在HL60细胞中过表达，为进一步研究长型LRP16基因功能奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。