Western印迹分析嗜人按蚊中肠膜蛋白免疫原性

采用Western-blot免疫学方法对嗜人按蚊中肠粗蛋白和膜蛋白(即纯化后的粗蛋白)分子量及免疫原性进行分析。结果,经SDS-PAGE电泳,嗜人按蚊中肠粗蛋白显示8条主带,分子量范围在(66200~15850Da);而膜蛋白显示4条主带,分子量范围在(66200~35480Da)。利用中肠粗蛋白免疫小鼠所获得的抗血清,可特异性识别粗蛋白中的3个条带;而特异性识别膜蛋白的仅1条,分子量为38·9kDa。可见,利用蔗糖不连续梯度离心可获得膜蛋白,该蛋白含有与抗蚊中肠粗蛋白抗体相结合的膜蛋白表面抗原,这对今后制备嗜人按蚊中肠单克隆抗体具有参考价值。     

辽宁省嗜人按蚊卵型多态性和杂交的研究

目的 :探讨辽宁省不同卵型嗜人按蚊的遗传关系及卵型变异。方法 :以甲板宽 10～ 2 5 μm为窄卵型、2 6～ 6 5 μm为中间型、无甲板或甲板不完整者为无甲板型 ,比较不同卵型的形态特征。以人工诱导法杂交 ,判定不同卵型嗜人按蚊是否存在生殖隔离。观察不同月份和不同世代嗜人按蚊的卵型变化 ;以辽宁株F1 2 和对照组四川株吸饱血蚊 ,分别置于实验室 2 0℃、 2 5℃和 30℃条件下产卵 ,观察不同温度条件下嗜人按蚊卵型变化规律 ;结果 :辽宁省嗜人按蚊平均卵长 6 15 7μm (5 5 0～ 6 70 ) ,卵宽 2 18 4 μm (190～ 2 4 0 ) ,甲板宽35 4 μm (10～ 6 5 ) ,约为卵宽的 16 2 % ,部分卵无甲板、甲板不完整或形态各异的卵型。 8月份捕自牛栏吸血蚊产中间型卵占 6 5 6 %、窄卵型 31 3%、无甲板型 3 1% ,9月份分别为 75 5 %、 12 0 %、 12 5 %。不同卵型种群间杂交实验结果显示不存在生殖隔离。F1 2 在 30℃条件下窄卵型占 82 7% ,中间型和无甲板型仅为13 3%和 4 1% ,然而在 2 0℃条件下 ,窄卵型降至 2 8 6 % ,中间型和无甲板型分别上升至 4 9 0 %和 2 2 4 % ,对照组四川株观察结果与辽宁株相类似。由此说明 ,实验室种群随着温度的升高 ,窄卵型的比例增多 ,中间型卵和无甲板型卵则减少。结论 :辽宁省嗜人     

广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度的比较

目的比较广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度，为控制疟疾爆发流行提供科学依据。方法采用按蚊密度调查等方法在广东省珠海市和惠州市进行媒介能量的调查和研究。结果广东省珠海市嗜人按蚊的媒介能量为5．863，中华按蚊为0．663；广东省惠州市嗜人按蚊的媒介能量为2．770，中华按蚊为0．249。结论嗜人按蚊的媒介能量是中华按蚊的8～11倍，说明嗜人按蚊在广东的传疟作用较中华按蚊更为重要，占主要地位。     

不同地区不同生境按蚊种群的分子鉴定及rDNA-ITS2序列分析

对采自安徽、江苏、湖南、广西、云南及海南等地区的人房、牛棚、稻田、山区等不同生境的按蚊,按照文献合成引物,用PCR方法进行分子鉴定;并对各种群的ITS2序列测序后,与GenBank所得赫坎按蚊复合体近缘种群按蚊的ITS2序列进行比对分析.结果显示,采集的不同地区不同生境的按蚊均为中华按蚊,此次采集没有采到嗜人按蚊;现场...     

微小按蚊复合体Rdna-ITS2序列差异及遗传多态性研究

本研究对我国微小按蚊广西、云南、海南 6个地理株和越南Caonguen株rDNA ITS2PCR扩增片段和序列差异作分析 ,获得基因片段总长为 5 6 1bp～ 5 6 3bp ,发现地理株间ITS2序列差异程度不同 ,分析表明元江株为微小按蚊C型 ;其余 6个地理株为A型。应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA ITS2PCR扩增片段作酶切分型 ,结果同样显示两型差异 ,从而简化微小按蚊复合体分类方法     

冈比亚按蚊嗅觉结合蛋白基因agCP1588的克隆鉴定及其组织特异性表达谱分析

昆虫主要依靠嗅觉发现寄主 ,嗅觉在按蚊的寄主搜索行为中起关键作用。本文基于冈比亚按蚊的全基因组序列 ,设计特异引物 ,采用RT -PCR克隆了该按蚊嗅觉结合蛋白候选基因agCP15 88。测序分析结果表明该基因具有嗅觉蛋白的标志性结构域 ,通过半定量RT PCR技术研究了该基因的组织特异性表达谱 ,发现该基因只在雌蚊触角中表达。这一发现为进一步研究该嗅觉蛋白基因的功能奠定了基础     

人β2微球蛋白基因的克隆与鉴定

人 β2微球蛋白基因 (β2 ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ,β2 Ｍ)位于染色体15ｑ2 1～ 2 2 .2 ,成熟蛋白产物由 99个氨基酸组成 ,是ＨＬＡ Ⅰ类分子的轻链 ,在ＣＤ8+ 细胞毒Ｔ细胞 (ＣＴＬ)反应中起重要作用。近年发展的ＨＬＡⅠ 肽四聚复合物 (ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘ)技术 ,就是通过基因工程制备ＨＬＡ Ⅰ类分子的轻链和重链 ,模拟靶细胞膜表面的ＨＬＡⅠ 表位复合物与Ｔ细胞受体 (ＴＣＲ)结合来检测Ｔ细胞群中相应表位的特异性ＣＴＬ[1] 克隆。为此 ,我们采用逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)克隆了 β2 Ｍ ,并进行了鉴…     

荧光定量PCR分析FGFR2基因多态性与乳腺癌的相关性研究

目的 探讨成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth faceor receptor 2,FGFR2)基因rs2981582位点单核苷酸多态性(single necleotide polymorhism,SNP)与乳腺癌易感性之间的关系.方法 建立新的荧光定量PCR检测rs2981582位点SNP,并对936例乳腺癌患者和471例良性乳腺疾病患者进行病例对照研究,分析该位点SNP与乳腺癌发生之间的关系.结果 对照组CC、CT、TT各基因型的例数及基因频率分别为234(49.68%)、181(38.43%)、56(11.89%).乳腺癌组总体各基因型例数及基因频率分别为426(44.56%)、400(41.84%)、130(13.60%),与对照组差异无统计学意义(P=0.183).进一步分层分析发现,雌激素受体(+)组各基因型例数及基因频率分别为189(41.27%)、202(46.12%)、67(14.63%),与对照组比较差异有统计学意义(P=0.035);而雌激素受体(-)组各基因型及基因频率分别为237(47.59%)、198(39.75%)、63(12.65%),与对照组比较差异无统计学意义(P=0.802).结论 FGFR2基因第2内含子SNPrs2981582与雌激素受体阳性乳腺癌的发生有显著关系,同时验证了用本方法检测大批量人群标本的SNP操作简便,检测耗时短,结果特异且费用较为低廉,适合于进行大规模样品的SNP快速测定.     

与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析

目的克隆及分析与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因。方法利用抑制性消减杂交 （ suppression subtractive hybridization, SSH）方法克隆大劣按蚊差异基因，并对与先天免疫相关的差异基因（文中命名为T6基因）进行生物信息学分析及半定量实验，分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化，探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。结果目前克隆的差异基因包含以下几类：①与先天免疫相关的酶类；②与能量代谢有关的酶：③与信号传递和调节有关的因子。对与先天免疫相关的分子进行的半定量实验表明，大劣按蚊T6基因的转录与感染疟原虫相关。结论本研究成功地克隆了与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因，进一步的实验分析提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关。     

我国辽宁省赫坎按蚊种团的分子鉴别研究

为更新和补充辽宁省按蚊多样性的本底资料,笔者对2008年在辽宁省5个地点采集的按蚊进行形态和PCR分子鉴别,并随机抽取已鉴别的和未获鉴别的样本,进行rDNA-ITS2序列测定和分析.本研究共鉴别了168个个体,均为赫坎按蚊种团成员种,分别是中华按蚊(n=14)、雷氏按蚊(n=4)、八代按蚊(n=113)、比伦按蚊(n=2)和克莱按蚊(n=35).     

对约氏疟原虫不同易感性的大劣按蚊和斯氏按蚊基因组RAPD序列比较

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组RAPD谱带并测序，探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法用已筛选的一条随机引物，随机扩增大劣按蚊和斯氏按蚊成蚊的基因组DNA，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，对相同迁移率的DNA条带克隆、测序，并采用相关在线程序及软件进行序列比较分析。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异，但有4对相同迁移率的条带。序列分析显示4对DNA条带在序列长度和组成上呈现多态性，序列的GC含量和简单重复序列存在差异，序列相似性介于48％～52％之间。结论大劣按蚊和斯氏按蚊之间存在不同的遗传背景，其基因多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关，为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

The ITS2 ribosomal DNA of Anopheles beklemishevi and further remarks on the phylogenetic relationships within the Anopheles maculipennis group of species (Diptera: Culicidae)

Anopheles beklemishevi specimens from Russia were analysed by their ITS2 ribosomal DNA sequence to amend and to specify the phylogenetic tree of the Anopheles maculipennis species complex. Surprisingly, with 638 base pairs, the ITS2 regions of all the 34 An beklemishevi specimens examined were considerably longer than those of all their sibling species. Sequence alignment with GenBank derived sequences of the other siblings was only possible in the beginning (for approx. 335 bp) and at the end (for approx. 150 bp) of the PCR-amplified DNA fragment, whereas in the middle, the An beklemishevi DNA sequence found no counterpart in sequences of the other siblings. Closer analysis of this intermediate part suggests a duplicated insertion of about 140 bp that has undergone subsequent mutational changes. Due to this large putative insertion, computerized phylogenetic analysis by the Bayesian inference method locates An beklemishevi in a closer relationship to the nearctic than to the palaearctic sibling species. However, when only ITS2 regions are compared, that have corresponding sequences in the other siblings, An beklemishevi forms a lineage with the palaearctic species although it is still most remotely related. It is hypothesized that during the evolution An beklemishevi separated first from the common ancestor of the palaearctic species, which had presumably made its way from the Nearctic to the Palaearctic.     

应用Affymetrix全基因组芯片检测染色体7q36区域的DNA拷贝数突变

目的 应用Affymetrix全基因组芯片结合荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,进行致病性DNA拷贝数变异的精细定位研究.方法 以一个定位于染色体7q36的中国人遗传性三节拇指多并指综合征伴随Ⅳ型并指家系中的一例患者为研究对象.收集外周血标本,常规提取基因组DNA.应用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片,将基因组DNA纯化,经过酶切、连接、扩增、标记、杂交、染色和扫描等步骤后得到原始数据,应用Affymetrix Genotyping Console 3.0软件进行拷贝数分析.在经芯片分析所确定的重复范围内设计引物,采用qPCR方法进行验证,并进一步缩小断端范围、精确重复区域范围.结果 将患者重复区域两断端范围由原来的113 kb和33 kb分别缩小到5.4 kb和1.8 kb,致病性DNA重复范围由原来的291～437 kb精确至379～387 kb.结论 应用Affymetrix全基因组芯片联合qPCR技术可以实现对DNA拷贝数突变的精确、可靠的检测.     

人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD226（PTA1）启动子及其5‘上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列，并分析人CD226基因5‘上游调控序列以及通过RT－PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD226基因在－375bp处和－130bp处可能有两个启动子，含有AP－1，Ets-1,Spl,P300,PU.1,PEA3等转录因子结合序列，在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD226基因表达受到多种转录因子和5‘端上游调控序列的调控。     

IL—2／HBV PreS融合基因的克隆及序列测定

目的：获得ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因克隆，为表达ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白奠定基础，方法：用ＰＣＲ方法从乙肝全序列中扩增ＨＢＶｐｒｅＳ基因片段，并克隆入带ＩＬ－２基因的ｐｌｙ５质粒中，挑出的阳性克隆再亚克隆到ｐＵＣ１８中进行序列测定。结果：基因全长９３０ｂｐ，编码３１０个氨基酸，序列内有起始码和终止码。结论：所克隆的基因为ＩＬ－２与ＨＢＶｐｒｅＳ的融合基因。