实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸载量的测量不确定度构成分析

目的 研究实时荧光定量PCR用于HBV核酸载量检测时的测量不确定度构成.方法 采用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清标本中HBV核酸载量,收集检测过程中的各类数据,计算以下6种来源的测量不确定度,对该方法的测量不确定度构成进行评估.(1)标本浓缩的不确定度(uenrich);(2)核酸提取的不确定度(uex);(3)扩增反应体系的不确定度(upcr);(4)热循环仪的不确定度(uins);(5)数据处理的不确定度(uana);(6)加样枪的不确定度(upip).其中热循环仪的不确定度检测样本数为7份,其他各种不确定度检测的样本数为10份.结果 核酸浓度为5.610E+07拷贝/ml的标本,其浓缩过程来源的相对不确定度达0.437核酸提取来源的浓度真值无偏估计在6.585E+03、9.067E+04、7.223E+06拷贝/ml样本的相对不确定度分别为0.249、0.173、0.140;热循环仪和数据分析来源的相对不确定度分别为0.020和不大于0.050.结论 标本制备过程中的浓缩和DNA提取步骤所带来的不确定度是实时荧光定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的主要分量,因此标本制备处理的方法与标准操作程序能否有效地提取核酸并去除PCR反应的抑制物对于该项检测十分关键;起始模板浓度与测量不确定度相关,低浓度的样本显示出更大的相对不确定度.     

实时定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的构成分析

 目的 研究实时荧光定量PCR用于乙型肝炎病毒（HBV）核酸载量检测时的测量不确定度构成。 方法 采用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清标本中HBV核酸载量，收集检测过程中的各类数据，计算以下6种来源的测量不确定度，对该方法的测量不确定度构成进行评估。⑴标本浓缩的不确定度（uenrich）；⑵核酸提取的不确定度（uex）；⑶扩增反应体系的不确定度（upcr）；⑷热循环仪的不确定度（uins）；⑸数据处理的不确定度（uana）；⑹加样枪的不确定度（upip）。其中热循环仪的不确定度检测样本数为7份，其他各种不确定度检测的样本数为10份。 结果 核酸浓度为5.610E+07拷贝/ml的标本，其浓缩过程来源的相对不确定度达0.437；核酸提取来源的浓度真值无偏估计在6.585E+03、9.067E+04、7.223E+06拷贝/ml样本的相对不确定度分别为0.249、0.173、0.140；热循环仪和数据分析来源的相对不确定度分别为0.020和不大于0.050。 结论 标本制备过程中的浓缩和DNA提取步骤所带来的不确定度是实时荧光定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的主要分量，因此标本制备处理的方法与标准操作程序能否有效地提取核酸并去除PCR反应的抑制物对于该项检测十分关键；起始模板浓度与测量不确定度相关，低浓度的样本显示出更大的相对不确定度。     

荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒DNA

目的：了解不同乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清HBV-DNA含量与乙肝血清免疫标志物的关系并探讨其临床意义。方法：用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法定量检测375例不同临床类型HBV感染者及70例正常人血清HBV-DNA含量。结果：血清HBsAg阳性组与HBeAg阳性组HBV-DNA的检出率及含量均明显高于HBsAg阴性组和HBeAg阴性组，且HBeAg即使阴性，不论HBeAb阳性组或阴性组均仍有较高的HBV-DNA检出率。不同临床类型HBV感染者中均有HBV-DNA的检出。结论：定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化，对乙型肝炎临床诊断及治疗均有一定的临床意义。     

脂血标本的核酸定量检测效果评价

目的评价脂血标本的核酸定量检测实时扩增曲线，以探讨此类标本进行HBVDNA定量检测的可接受性。方法建立扩增曲线观察法、扩增效率Grubbs离散值分析法及扩增效率置信区间估计法，评价接收脂血标本进行荧光定量PCR法HBVDNA定量检测的有效性。结果该2批次扩增的各样品扩增效率数值未发现离散值，3例脂血标本的扩增效率在同批样品扩增效率的90％置信区间内，与扩增曲线观察法结果一致。结论3种评价方法均对修正标准操作程序以接收该类标本提供了支持性的依据。     

一种国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂不同检测平台上的验证情况分析

目的 将圣湘公司乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)在不同荧光定量PCR系统进行性能验证,以给出该试剂盒在不同检测平台上的性能评价.方法 依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)颁布的EP系列文件和《医学实验室质量和能力认可准则》相关文件,应用Roche LightCycler(R)480 Ⅱ实时荧光定量PCR系统及美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统对圣湘公司乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行临床样本精密度、正确度、可报告范围和检测下限的性能验证实验.结果 LightCycler(R)480 Ⅱ实时荧光定量PCR系统:2×106 IU/mL浓度水平批内精密度为1.38％,批间精密度为0.25％;2×104IU/mL浓度水平批内精密度为0.35％,批间精密度为0.79％.正确度验证可溯源标准品,偏倚均小于7.5％,符合厂家说明及文件要求.HBV DNA定量结果在2.1×102IU/mL至2.1×107IU/mL浓度水平范围内线性关系良好(R2=0.9994),临床可报告范围为2.1×102IU/mL～2.1×108IU/mL.该系统检测下限为148 IU/mL.ABI 7500型实时荧光定量PCR系统:2×106IU/mL浓度水平批内精密度为0.70％,批间精密度为1.34％.2.5×104IU/mL浓度水平批内精密度为1.18％,批间精密度为3.01％.正确度验证可溯源标准品,偏倚均小于7.5％,符合厂家说明及文件要求.HBV DNA定量结果在2×102IU/mL至2×10sIU/mL浓度水平范围内线性关系良好(R2 =0.9991),临床可报告范围为2×102IU/mL ～2×109IU/mL.该系统检测下限为203 IU/mL.结论 圣湘公司乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)在Roche LightCycler(R)480 Ⅱ实时荧光定量PCR系统及美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统上的性能验证结果均符合试剂说明书性能范围,检测结果无明显差异,均可准确快捷的对HBV DNA定量检测,为后续超敏定量工作奠定基础.     

荧光定量 PCR与半定量PCR检测HBV DNA的对比分析

目的：对照分析荧光定量PCR与半定量PCR检测血清HBV DNA的载量，为临床基因检测实验室提供方法学选择依据。 方法： 取164份临床检测标本各用荧光定量PCR与半定量PCR检测，结果作统计学分析。 结果: 两种检测方法的灵敏度和特异度没有显著差异（χ2 =1.75，P>0.05）。 结论: 临床基因检测实验室可用半定量PCR法替代荧光定量 PCR法检测血清HBV DNA的载量。     

聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床意义分析

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染时,外周血中ＨＢＶＤＮＡ是病毒复制最直接和可靠的标志。自１９８５年以来,国外应用核酸分子杂交法、定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）法检测ＨＢＶＤＮＡ含量［１］,国内也有一些报道［２］。北京佑安医院自１９９６年１月至１９９７年８月采用...     

核酸试纸条法检测HBV基因型方法的建立

目的 建立一种快速、肉眼可观测的方法检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型.方法 根据GenBank中已发表的明确HBV分型全序列,设计特异的引物和标记生物素探针,建立核酸试纸条法检测150例乙型患者和20例健康体检者的乙型肝炎基因型,同时采用荧光定量PCR法进行比较.结果 150例标本中B型检出率为34.00%(51/150),C型占61.33%(92/150),B/C混合型占4.00%(6/150),未分型占0.67%(1/150).与荧光定量PCR法进行比较,结果一致.结论 核酸试纸条法检测HBV基因型与荧光定量pCR法相比较灵敏度和特异性相似,但该方法更简便、快速,更适合临床开展.     

锁核酸结合分子信标技术检测乙型肝炎病毒DNA G1896A点突变研究

目的研究和评估乙型肝炎病毒（HBV）DNA G1896A点突变的实时荧光PCR检测方法。方法收集经测序验证HBV DNA G1896A未突变的野生型样本150例和已发生突变的突变型样本58例,在突变区域设计分子信标探针,点突变处进行锁核酸处理,利用荧光PCR方法检测HBV前C区G1896A点突变;再从临床标本中随机抽取18例、8例和19例荧光PCR结果分别显示为G1896A突变的标本、杂合的标本以及野生型的标本的PCR产物进行序列测定。结果突变型质粒和野生型质粒的检测灵敏度均可以达到100copies/ml;突变型探针检测高浓度的野生型质粒时无检测信号,野生型探针检测高浓度突变型质粒时无检测信号;突变型模板在总杂合模板中的比例达到5%时则都可以将突变型检测出来;序列测定的8例G1896A突变标本、6例杂合标本和19例野生型标本的PCR产物结果和荧光PCR检测结果完全吻合。结论实时荧光PCR检测方法可以快速、简便、准确地检测HBVDNAG1896A点突变,是检测点突变的重要方法,具有重要的临床应用价值。     

EB病毒核酸定量检测试剂性能验证及评价

目的验证EB病毒核酸定量检测试剂的分析性能是否与厂商提供参数相符从而评估检测指标对于临床的服务能力。方法采用首都医科大学附属北京地坛医院收集的不同浓度的临床标本,对EB病毒核酸定量检测试剂的精密度、准确性、线性范围等性能参数进行方法学性能验证和评价。结果高浓度和低浓度标本的批内精密度CV值(0.58%,2.3%)及批间精密度CV值(2.25%,0.49%)均≤5%,符合要求。准确性验证偏移(1.47%、2.99%、-1.89%、-3.10%、-0.30%和-2.68%)均≤7.5%的标准,符合要求;在7.74×10~6.71×10^6IU/mL分析测量线性范围良好。结论通过验证,EB病毒核酸定量检测试剂可以满足目前EB病毒的筛查和临床疗效监测的需要,适用于临床常规检测。     

550例乙肝病毒携带产妇乳汁HBV-DNA的检测及分析

目的了解乙型病毒性肝炎（简称乙肝）病毒携带产妇血清乙肝病毒DNA（HBV-DNA）含量、乙肝血清免疫学指标与乳汁中HBV-DNA含量及阳性率的关系，以指导母乳喂养。方法选择诊断为乙肝携带者的产妇550例（血清HBV-DNA定量分析呈阳性，酶联免疫法检测为大三阳或小三阳），采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术测定其乳汁中HBV-DNA含量，并对所有检测指标进行相关性分析。结果血清HBV-DNA阳性产妇的乳汁中检出HBV-DNA398例，总阳性率为71.5％，且乳汁HBV-DNA的阳性率随血清HBV-DNA含量的升高而增高；血清HBV-DNA的含量与乳汁HBV-DNA的含量呈正相关（r=0．531，P〈0．05）大三阳产妇与小三阳产妇乳汁HBV-DNA阳性率差异有显著性意义（χ^2=369．4，P〈0．01）。结论血清HBV-DNA阳性产妇均应作乳汁HBV-DNA检测；乳汁HBV-DNA检测对正确指导乙肝产妇进行母乳喂养有一定实用价值。     

FQ—PCR检测乙型肝炎HBVM和前S1抗原不同模式的HBV—DNA含量及意义

目的评价实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术在乙型肝炎诊断和治疗中的应用价值。方法用FQ-PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）同时检测693份初诊标本和治疗3个月前后231份复诊病人标本的HBVM和HBV-DNA。结果HBVM模式共16组，其中HBeAg（＋）组HBV-DNA检出率98．3％，定量对数值均在6．49以上；HBeAg（-）但前S1抗原（＋）组HBV-DNA检出率93．6％，定量对数值为4．48±1．40；HBsAg（＋）HBcAb（＋）前S1抗原（-）组HBV-DNA检出率51．6％，定量对数值为4．46±1．43；HB-sAg（＋）HBeAg（-）HBcAb（-）组HBV—DNA检出率16．7％，定量对数值为4．29±0．43；HBsAg、HBeAg、前S1抗原同为（-）组HBV-DNA检出率很低且定量对数值也低。大、小三阳患者治疗3个月后HBV—DNA定量对数值改变1．5以上者，分别为50．0％、31．4％。结论FQ-PCR定量检测HBV-DNA对乙型肝炎诊断、治疗、预后判断具有重要的指导意义。     

HBV-LP与HBV-DNA联检的临床应用

目的：探讨血清乙型肝炎病毒大蛋白与HBV-DNA联检在乙型肝炎患者诊治中的意义。方法：对162例HBV感染者及47名健康对照组血清采用ELISA检测乙型肝炎病毒大蛋白及乙型肝炎病毒标志物;FQ-PCR定量检测HBV-DNA。结果：162例HBV感染者血清中,HBV-LP浓度与HBV-DNA拷贝数间具有良好的正相关性（rs=0.64,P〈0.001）,不同HBV-DNA拷贝数组别间HBV-LP浓度存在差异显著性（P〈0.01）;HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg间均关联显著（P〈0.01）。HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg间阳性率均存在差异显著性（P〈0.05）,HBV-LP阳性率为84.57%,较HBV-DNA、HBeAg均敏感。其中HBV-LP在HBV-DNA阳性组中阳性率为91.18%（93/102）,DNA阴性组中阳性率为73.33%,均较HBeAg高;在58例HBV-DNA和HBeAg共同阴性的HBV感染血清中,HBV-LP检出42例阳性。结论：血清HBV-LP浓度与HBV-DNA联检有利于提高HBV感染者体内病毒复制、疾病进程、疗效与预后判断的血清学诊断与监测水平。     

血清乙肝病毒大蛋白在HBeAg阴性和低水平HBV-DNA乙肝患者中的检测意义

为了探讨血清乙肝病毒大蛋白在HBeAg阴性与低水平HBV-DNA乙肝患者中的检测意义。对162例HBV感染者及47名健康对照血清采用酶联免疫吸附试验检测乙肝病毒大蛋白、乙肝病毒前S1抗原、病毒前S2抗原及乙肝病毒标志物;FQ-PCR定量检测HBV-DNA。结果显示:162例HBV感染者血清中,HBV-LP浓度与HBV-DNA拷贝数间具有良好的正相关性(rs=0.64,P<0.001),不同HBV-DNA拷贝数组别间HBV-LP浓度存在差异显著性(P<0.01);HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HBVpreS1间均关联显著(P<0.01)。HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HBVpreS1间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为84.57%,较HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HB-VpreS1均敏感。其中HBeAg阴性组中HBV-LP与HBVpreS1、HBVpreS2、HBV-DNA间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为76.77%(76/99),较HBV-DNA,HBVpreS2,HBVpreS1均高(P<0.01);DNA阴性组中HBV-LP与HBVpreS2、HBVpreS1、HBeAg间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为73.33%,较HB-VpreS2、HBVpreS1、HBeAg均高。血清HBV-LP浓度是反映血清HBeAg阴性和低水平DNA的HBV感染者体内病毒复制、疾病进程、疗效与预后判断的新的敏感监测指标。     

Detection of HBV-DNA by in situ hybridization using a biotin-labeled probe

A biotin-labeled DNA probe specific for hepatitis B virus (HBV) nucleotide sequences was hybridized in situ to liver tissue of 20 patients; 16 were chronic carriers of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and 4 had no markers of HBV infection. HBV-DNA was also analyzed in the serum and the liver of these patients by spot and Southern blot hybridization, respectively. Liver specimens from six carriers were positive for HBV-DNA both by in situ and Southern blot hybridization; ten carriers were negative by in situ hybridization, and two of these were positive by Southern blot technique. The staining was granular, mainly cytoplasmic, limited to liver specimens containing replicative forms of HBV-DNA, and associated with detection of HBcAg in hepatocytes by immunofluorescence. The sensitivity of this technique was not sufficient to detect few copies of integrated HBV-DNA. The hybridization procedure was specific, as results were constantly negative in liver specimens of patients without markers of HBV infection, and no reaction was observed using DNA probes lacking HBV-DNA sequences. Detection of HBV-DNA by in situ hybridization, using a biotinylated probe, is a rapid, reproducible, and specific histochemical method. Currently available biotinylated probes are advantageous when absolute sensitivity is not the limiting factor, and they also facilitate studies of the cellular and subcellular distribution of HBV nucleic acids.     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立检测HBV病毒DNA的荧光定量PCR法（FQ-PCR）,并与运用常规凝胶电泳技术观察特异扩增带检测的结果加以比较。方法 合成扩增HBV DNA314bp特异保守序列的1对引物及1条带2个荧光基团的寡核苷酸探针。用PE-5700型定量PCR仪完成PCR反应及产物的荧光定量检测。同是PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,UVP（凝胶成像仪）检出有314bp带者为阳性或弱阳性。结果 建立了检测HBVDNA的荧光定量PCR技术,用已知HBV阳性模板不同拷贝数的标准溶液测得标准曲线Ct,原始拷贝数在10^5/ml以上者为阳性,用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定性PCR观察到193例有阳性特异带,阳性检出率为27.65%。没有发现用定性PCR检测为阳性而用FQ-PCR检测为阴性者。结论 FQ-PCR检测HBVDNA较普通定性PCR技术具有操作简便,灵敏度更高、减少发生污染可导致假阳性结果的可能性及自动化程度高等优点,值得在临床检验中推广应用。     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA与HBsAg、HBeAg的相关性分析

目的 研究e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血中HBV-DNA载量与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的相关性,及其在不同性别、年龄群体中的差异.方法 收集319例e抗原阳性慢性乙肝患者血清,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量,用时间分辨免疫荧光法检测HBsAg和HBeAg的浓度,利用SPSS软件做统计分析.结果 HBV-DNA载量与HBsAg含量有良好的相关性（r=0.514,P〈0.001）;与HBeAg含量有相关（r=0.337,P〈0.001）;女性的HBeAg水平要高于男性患者（P〈0.05）;年龄（31～50）岁组、〉50岁组的HBV-DNA、HBsAg 及HBeAg值皆高于年龄 〈30岁组 （P〈0.001）.结论 e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg定量水平皆有相关性,其中与HBsAg相关性更佳.     

罗氏Light Cycler480实时荧光定量PCR系统检测HBV-DNA性能验证

目的 探讨适合本实验室的荧光定量PCR检测HBV-DNA的性能验证方法,评估其是否能满足临床使用要求.方法 参考GB/T 20470-2006《临床实验室室间质量评价要求》,应用实验室检测患者标本、第三方质控品、卫生部临检中心室间参考物质等,按方法学性能评价指标设计验证试验,对检测结果的精密度、准确度,线性范围和参考区间等参数进行性能验证.结果 本检测系统批内精密度和总精密度CV均小于＜5％;分析NCCL发放的高低水平的室间质评参考物,检测结果与靶值的偏倚分别为0.25IU/mL、0.23IU/mL,检测结果偏倚在-0.4～ 0.4IU/mL范围内;线性范围验证结果显示,线性回归方程为Y=0.998X-0.056,R2=0.998,斜率在0.95～ 1.05之间,截距接近于0;参考区间评价结果显示20例健康体检者HBV-DNA定量检测结果均在参考区间内(＜500IU/mL),说明引用的参考区间有效.结论 罗氏Light Cycler 480实时荧光定量PCR系统检测HBV-DNA性能指标均达到规定要求,能满足临床预期要求.     

Kinetics of HBV DNA and HBsAg in acute hepatitis B patients with and without coinfection by other hepatitis viruses

The kinetics of hepatitis B virus (HBV) and its surface antigen (HBsAg) during acute hepatitis has not yet been studied accurately in a representative number of patients. The influence of coinfecting hepatitis viruses during the acute phase of infection is not known. Three to four serum samples from 21 patients with acute HBV monoinfection and 27 with coinfection were taken at intervals of 6-10 days and analyzed for the number of HBV genome equivalents (ge) by real time polymerase chain reaction (PCR) and for HBsAg quantity using Laurell electrophoresis. Log HBV ge/ml decreased during the follow-up from 6.8 +/- 1.1 to 5.1 +/- 1.0 to 4.2 +/- 0.8 to 3.3 +/- 1.1 (mean +/- SD). The half-life times of HBV ge increased from 1.6 days at the beginning to 4 days at the end. HBsAg decreased much slower: from 38 to 23 to 12 to 3.8 microg/ml. Half-life time was around 8 days at the beginning and 5.7 days at the end, but 11 patients showed a rapid elimination of HBsAg and HBV DNA. Hepatitis C virus (HCV) coinfection did not change the kinetics of HBV ge and HBsAg significantly. A moderate but significant suppression of HBV ge levels was observed in hepatitis D virus (HDV) coinfected patients. HBsAg levels were, however, enhanced in this cohort. In conclusion, the data suggest that expression and elimination of HBV is in most patients with acute hepatitis B not altered by coinfecting hepatitis viruses. The initial decrease of HBV ge and HBsAg in serum appears to be caused by decay or non-specific removal in the absence of replacement.