华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

华支睾吸虫ATP合酶B亚基全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别ATP合酶B亚基,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,用以指导实验研究。方法利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Vector NT Isuite软件包,识别华支睾吸虫ATP合酶B亚基基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果Blastx分析该基因为全长基因,属于ATP合酶B亚基家族,其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp,编码300个氨基酸,含有线粒体转运肽、两个跨膜区、一个核定位序列和多个磷酸化位点,具有较稳定的理化性质。结论ATP合酶B亚基是一个理想的真核种系进化的分子标志。华支睾吸虫ATP合酶B亚基具有线粒体和细胞核的双重定位序列,提示该蛋白可能在华支睾吸虫的能量代谢途径中发挥独特的调节作用。     

华支睾吸虫成虫CsRPEF基因的生物信息学分析

目的筛选华支睾吸虫的功能基因并进行相应的生物信息学分析。方法使用PCGENE软件、Antheprot-5软件、ExPAsv在线分析工具、NCBI上的Blastx程序进行华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子（CsRPEF）基因的生物信息学分析。结果获得了CsRPEF基因的序列特征,推测到了CsRPEF的同源蛋白并预测出CsRPEF编码蛋白的分子量、等电点、柔曲性、疏水性、功能性位点等二级结构特征。结论华支睾吸虫成虫CsRPEF基因是-新筛选的功能基因,CsRPEF蛋白是可能参与华支睾吸虫基因转录途径的重要因子。CsRPEF基因的生物信息学分析可为其进一步进行生物学功能的实验研究奠定基础。     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白（CsMLP）进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET．28a（＋）中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET．28a（＋）-CsMLP重组质粒构建成功;SDS—PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21／DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性．其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

华支睾吸虫卵黄前体蛋白B基因的识别、序列分析和克隆表达

为识别和克隆华支睾吸虫新基因 ,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序 ,并利用在线生物信息学工具进行序列分析 ,识别华支睾吸虫未知基因 ,同时根据PGEX -4T- 1多克隆位点及未知基因的序列设计引物 ,PCR扩增目的基因 ,并构建原核重组质粒。结果发现了CsvpB基因 ,其完整阅读框含 76 2个碱基 ,编码 2 5 4个氨基酸 ,理论分子量为 2 7. 7kDa。序列分析表明 ,CsvpB蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性 ,所构建的重组原核表达质粒PGEX- 4T- 1 vpB经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。     

细粒棘球绦虫烯醇酶（EgEnolase）基因的克隆和序列分析

目的细粒棘球绦虫烯醇酶基因（EgEnolase）的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析。方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPaSy,http：//ca.expasy.org/）,以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签（EST）数据库中发现烯醇酶的5’端和3’端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应（PCR）方法扩增其基因组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物,采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景。结果细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1449bp,含有两个长度分别为78bp和69bp的小内含子。该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区（aa104-124）,N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2＋结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心。该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199。该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210。结论细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达。     

寄生虫学

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定；恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序；海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因Pfmdr1多态性分析；间日疟原虫MSPIC端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达；NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫感染免疫效应中的作用；IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠Th1／Th2细胞因子表达水平的影响；儿童先天性病残与弓形虫感染关系的研究；宫内感染弓形虫影响儿童生长发育的观察；弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定；弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅱ．pcDNA3-HBsAg-GRA1在COS-7细胞中的表达及鉴定；弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达；小鼠过继转移致敏小肠IEL抗弓形虫感染；弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大，肠杆菌中的表达；卡氏肺孢子虫肺炎动物模型的实验观察；丝虫特异IgG4检测试剂盒的研制；日本血吸虫FKBP12基因的原核克隆表达及表达产物的纯化；日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定；左旋咪唑防御日本血吸虫尾蚴感染的实验研究；核酸疫苗VR1012／Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的研究；日本血吸虫染色体核型及其G带带型分析；蚯蚓与日本血吸虫间共同抗原的初步研究；致弱日本血吸虫尾蚴感染小鼠皮肤组织中CD11c分子的动态表达；日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定；日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达；Mago nashi：一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定；CpG ODN对B本血吸虫感染小鼠Th1／Th2细胞因子表达水平的影响；日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定；日本血吸虫精蠹酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析；日本血吸虫天然抗原分子的柱纯析分离纯化与鉴定；铜锈环梭螺（Bellamya aeruginosa）作为广州管圆线虫中间宿主的发现；抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究；华支睾吸虫病大鼠肝细胞凋亡的实验研究；猪囊尾蚴液、固相多种抗原对囊虫病免疫诊断效果评价。     

血链球菌ATCC10556中保守蛋白基因的克隆与分析

目的 克隆并分析血链球菌ATCC10556菌株中一种保守蛋白完整基因。方法 利用Southern印迹杂交分析法、分子克隆及斑点杂交技术获得含有特异片段的目的克隆，对该目的克隆测序，并利用计算机软件和生物信息学技术对克隆的基因及编码蛋白进行分析。结果 首次发现并克隆了血链球菌ATCC10556菌株中完整的保守蛋白基因。将其命名为Sscp基因，该基因在Genbank的登录号：AY032739，该基因编码一种跨膜蛋白，含有两个AAA结构域，结论 Sscp基因编码蛋白的功能与大肠杆菌FtsK相似。参与血链球菌细胞分裂活动。     

日本血吸虫毛蚴相关蛋白基因SjMP13的克隆表达及免疫学鉴定

利用日本血吸虫感染者唾液免疫筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,对获得的阳性克隆进行序列分析,其中一阳性克隆插入片段包含一个351 bp的开放读码框,其编码116个氨基酸,预测分子量为12.9 kDa,将其命名为SjMP13,该蛋白与血吸虫尾蚴相关蛋白(GenBank序列号:AF448823.1)同源性高达96%.将该序列克隆入原核表达质粒pET32a(+)并转化宿主菌B121/DE3,经IPTG诱导表达后,其重组表达产物经亲和层析纯化,再用Western-blot进行免疫学分析,该序列的原核表达产物能被日本血吸虫感染者唾液以及血清识别,提示该分子具有诊断抗原的开发价值.     

rSj26-Sj32融合蛋白用于慢性日本血吸虫病的诊断研究

目的:探讨rSj26-Sj32融合蛋白用于慢性日本血吸虫病的诊断价值.方法:用rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸虫成虫粗抗原(SjAWA)作为包被抗原建立酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)和dipstick三种方法检测慢性日本血吸虫病患者血清特异性IgG抗体,同时以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型棘球蚴病和囊型棘球蚴病患者以及健康人血清作为对照.结果:rSj26-Sj32融合蛋白通过三种方法检测慢性日本血吸虫病的敏感性分别为95.00%、92.50%和92.50%;特异性分别为97.67%、95.35%和97.67%.结论:rSj26-Sj32融合蛋白可用于慢性日本血吸虫病的免疫诊断.     

亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1（elongation factor 1,EF-1）基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：∥ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能。结果该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162。结论应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因。     

SAGEmap: a public gene expression resource

We have constructed a public gene expression data repository and online data access and analysis, WWW and FTP sites for serial analysis of gene expression (SAGE) data. The WWW and FTP components of this resource, SAGEmap, are located at http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sage and ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/sage, respectively. We herein describe SAGE data submission procedures, the construction and characteristics of SAGE tags to gene assignments, the derivation and use of a novel statistical test designed specifically for differential-type analyses of SAGE data, and the organization and use of this resource.     

生物信息学分析亚洲牛带绦虫WD40基因及其蛋白质的结构与功能

目的 分析和预测亚洲牛带绦虫WD40基因及其编码蛋白的结构和特性，用于指导其生物学功能的实验研究。方法 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY，http：／／ca．expasy．org／）和IEDBAnalysisRecource提供的各种生物信息学在线分析程序，结合其它生物信息学分析软件包如Pcgene和VectorNTIsuite，从亚洲牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别WIMO基因及其编码区，分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。结果 该基因全长1208bp，编码区为81～1056bp，编码402个氨基酸，为全长基因；无跨膜区，具有多个磷酸化位点，蛋白的理化性质稳定，理论分子量为35942．4；没有质体、线粒体定位序列；预测该蛋白表面有三个亲水性强的线性表位和三个B细胞抗原表位。结论 应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫WD40基因，并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行了预测。     

猪带绦虫乳酸脱氢酶A和B的生物信息学比较分析

目的预测及比较分析猪带绦虫乳酸脱氢酶A（Taenia solium lactate dehydrogenase A,TsLDH-A）和乳酸脱氢酶B（Taenia solium lactate dehydrogenase B,TsLDH-B）,用于指导其生物学功能的研究。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：//ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别LDH-A和LDH-B的全长编码基因并对其结构与功能进行生物信息学预测分析。结果两序列都是包含完整开放阅读框的全长基因,推导出的氨基酸序列与其它物种LDH-A或LDH-B同源基因的氨基酸序列的一致性均大于50%。两者编码的蛋白在编码的氨基酸数目（331）、蛋白的理化性质、L-乳酸脱氢酶结构域、构成LDH酶催化中心的关键氨基酸、包含LDH活性位点的线性表位、无亚细胞定位等方面是一致的,但两者在翻译后的修饰位点、3个跨膜区和其他线性表位方面既相似也有区别。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A和TsLDH-B的cDNA全长序列,并预测和比较了两者结构与功能方面的信息,为进一步研究所编码蛋白的功能奠定了基础。     

A complex phenotype in a family with a pathogenic SOX3 missense variant

Duplications and deletions of Xq26-27 including SOX3 (Xq27.1) have been associated with X-linked mental retardation and isolated growth hormone deficiency (OMIM 300123) or X-linked panhypopituitarism (OMIM 312000). Yet, pathogenic point mutations seem to be extremely rare. We report a family with three affected males with several clinical features including mild intellectual disability, microphthalmia, coloboma, hypopituitarism, facial dysmorphology and dental anomalies, including microcephaly, retrognathia and a solitary median maxillary central incisor amongst other features. Using Whole Exome Sequencing a missense variant in SOX3, NM_005634.2:c.449C>A; p.(Ser150Tyr) was identified. Segregation analysis in the family demonstrated that the variant was inherited through healthy females with its origin in the maternal grandmother showing germline mosaicism. Thus, we report one of the first cases of a pathogenic variant in SOX3 and germline mosaicism of this variant.     

淡色库蚊性别差异表达cDNA文库的构建和分析

目的为探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用，建立传播疾病的淡色库蚊性别差异表达cDNA文库。从而筛选阻断疾病传播的疫苗候选分子。方法以淡色库蚊雌蚊成蚊为检测方（Tester）、雄蚊成蚊为驱动方（Driver），进行正向抑制性消减杂交；以雄蚊成蚊为Tester、雌蚊成蚊为Driver，进行反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T easy vector，并以菌液PCR扩增鉴定插入片段。随机抽取100个阳性克隆进行DNA序列分析，并将所得ESTs序列进行在线BLAST分析。结果从100个阳性克隆中测得98个ESTs序列，在测定的序列中与已知基因具有同源性的有57个，其余41个ESTs与已知基因不具有同源性。结论抑制性消减杂交技术建立雌蚊特异性基因文库，发现了淡色库蚊雌蚊新的ESTs序列，为性别相关基因的功能及性别调控。探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用及其筛选传播阻断疫苗候选分子的研究奠定了基础。     

Identification and characterization of microRNAs in Trichinella spiralis by comparison with Brugia malayi and Caenorhabditis elegans

Trichinella spiralis is an important zoonotic nematode causing trichinellosis which is associated with human diseases such as malaise, anorexia, nausea, vomiting, abdominal pain, fever, diarrhea, and constipation. microRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs that play important roles in the regulation of gene expression. The objective of the present study was to examine the miRNA expression profile of the larvae of T. spiralis by Solexa deep sequencing combined with stem-loop real-time polymerase chain reaction (PCR) analysis. T. spiralis larvae were collected from the skeletal muscle of naturally infected pigs in Henan province, China, by artificial digestion using pepsin. The specific identity of the T. spiralis larvae was confirmed by PCR amplification and subsequent sequence analysis of the internal transcribed spacer of ribosomal DNA. A total of 17,851,693 reads with 2,773,254 unique reads were obtained. Eleven conserved miRNAs from 115 unique xsmall RNAs (sRNAs) and 12 conserved miRNAs from 130 unique sRNAs were found by BLAST analysis against the known miRNAs of Caenorhabditis elegans (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Caenorhabditis_elegans) and Brugia malayi dataset (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomeprj?Db=genomeprj&cmd=ShowDetailView&TermToSearch=9549) in miRBase, respectively. One novel miRNA with 12 precursors were identified and certified using the reference genome of B. malayi, while no novel miRNA was found when using the reference genome of C. elegans. Nucleotide bias analysis showed that the uracil was the prominent nucleotide, particularly at the 1st, 6th, 18th, and 23th positions, which were almost at the beginning, middle, and the end of the conserved miRNAs. The identification and characterization of T. spiralis miRNAs provides a new resource to study regulation of genes and their networks in T. spiralis.     

High-expressed CKS2 is associated with hepatocellular carcinoma cell proliferation through down-regulating PTEN

Background

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a product of cumulative genetic, epigenetic, somatic, and endocrine aberrations. Identifying the differentially expressed genes (DEGs) in HCC is of critical importance for diagnosis and treatment. The purpose of the present study was to screen the key genes associated with hepatocellular carcinoma and to investigate the functions underlying hepatocellular carcinoma progression.

左炔诺孕酮宫内缓释系统在妇科疾病治疗中的作用

背景：左炔诺孕酮宫内缓释系统有很高的避孕可靠性,可对子宫内膜产生明显的抑制作用。 目的：阐述左炔诺孕酮宫内缓释系统在妇科疾病治疗中的作用。 方法：由第一作者检索CBM、PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)、万方数据库(http://www. wanfangdata.com.cn)及google学术网1990/2010有关左炔诺孕酮宫内缓释系统治疗妇科疾病的文献,排除重复性研究。 结果与结论：共保留17篇文献进行归纳总结。结果显示,左炔诺孕酮宫内缓释系统作为释放微量孕激素的宫内缓释系统,可安全、有效地应用于避孕,治疗月经过多、内异症、子宫腺肌病,以及激素替代治疗中对子宫内膜的保护等,对治疗子宫肌瘤引起的月经过多也有良好效果。提示左炔诺孕酮宫内缓释系统治疗妇科疾病效果显著,但还需要大样本、长期的临床研究加以验证。