亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1（elongation factor 1,EF-1）基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：∥ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能。结果该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162。结论应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因。     

生物信息学分析亚洲牛带绦虫WD40基因及其蛋白质的结构与功能

目的 分析和预测亚洲牛带绦虫WD40基因及其编码蛋白的结构和特性，用于指导其生物学功能的实验研究。方法 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY，http：／／ca．expasy．org／）和IEDBAnalysisRecource提供的各种生物信息学在线分析程序，结合其它生物信息学分析软件包如Pcgene和VectorNTIsuite，从亚洲牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别WIMO基因及其编码区，分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。结果 该基因全长1208bp，编码区为81～1056bp，编码402个氨基酸，为全长基因；无跨膜区，具有多个磷酸化位点，蛋白的理化性质稳定，理论分子量为35942．4；没有质体、线粒体定位序列；预测该蛋白表面有三个亲水性强的线性表位和三个B细胞抗原表位。结论 应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫WD40基因，并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行了预测。     

高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。方法:在高温致神经管畸形动物模型上,提取高温致畸金黄地鼠胚胎神经管总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成cDNA第1链,经LD-PCR合成全长双链cDNA,去除小于500 bp的片断后与λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成未扩增cDNA文库,再进行文库扩增。测定未扩增和扩增文库的滴度及重组率;随机挑取噬菌斑,经PCR扩增,电泳检测所构建cDNA文库的质量。结果:未扩增文库滴度为2.03×106pfu/ml,重组率为98.4%,文库扩增后滴度达2.503×109pfu/ml,重组率为97.6%。插入片段长度分布于500~3 000 bp之间。结论:成功地构建了高质量的高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。     

生物信息学分析牛带绦虫烯醇酶基因及其蛋白的结构和特性

目的 分析和预测牛带绦虫成虫烯醇酶基因及其编码蛋白的结构和功能,用于指导其生物学功能的实验研究。方法 利用生物信息学网站的各种在线分析工具,并结合其它大型生物信息学分析软件包,如Vector NTI suite,分析从牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别的烯醇酶基因的结构和编码区序列,并分析、预测编码的蛋白质的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。结果 该基因全长1 641 bp,编码区为133～1 096 bp,编码320个氨基酸,相对分子量理论预测值为34866.8 Mr。具有一从内到外的跨膜区,无各种亚细胞定位序列,具有多个潜在的磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定。有13个主要的B细胞抗原表位。结论 通过生物信息学分析从牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中发现烯醇酶基因,并预测得到其结构与功能方面的信息。     

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆，为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物，QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA，长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接，转化人感受态细胞E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆。将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆，可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。     

虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建及其表达模式与成虫表达模式的EST分析

从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫,提取其总RNA ,运用“SMARTcDNA文库构建试剂盒”构建其cDNA文库。分别将成虫和幼虫cDNA文库中的噬菌体克隆转化成噬菌粒,用5′端测序引物进行测序。利用BLAST程序对获取的EST从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索。结果显示:所建文库的初始滴度为2 19×10 .6 pfu mL ,经1次扩增后的滴度为1. 0×10 1 0 pfu mL ,插入子的平均长度为1. 2kb ,重组率为97 .3%。从成虫的cDNA文库中得到6 4个EST ,其中有意义的EST有5 4个,占82 . 8% ;无意义的EST有10个,占17. 2 %。6 4个成虫EST序列中,rRNA基因4 9个,占总EST数的76 6 %。从幼虫的cDNA文库中共得到10 6个EST ,其中有意义的EST有91个,占85 . 8% ;无意义的EST有15个,占14 . 2 %。10 6个幼虫EST序列中rRNA基因78个,占总EST数的73. 6 %。本研究首次成功构建了广州管圆线虫幼虫的cDNA文库,EST分析显示广州管圆线虫幼虫和成虫基因表达谱中rRNA基因均占大多数。     

hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pE...     

多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析

从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA,以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,利用Lambda ZAP II XR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库.从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR,确定文库重组率和插入外源基因片段大小,鉴定文库质量.结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1.0×1...     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定.方法 将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后,以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo(dT)为引物反转录后连接attB衔接子(attB Adapter),层析柱纯化,通过BP重组反应将500 bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONRTM222载体,电转化入ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells,构建Gateway入门cDNA文库,并完全随机挑取单菌落,提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小.构建Gateway目的 载体,通过LR重组反应将入门文库转入此目的 载体成为酵母表达文库,挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小.结果 经鉴定,入门文库平均滴度为(6.80±0.10)×105 cfu/ml,文库总容量为7.48×106 cfu,平均插入片段为(2.20±0.20)kb,重组率为100%.酵母表达文库平均滴度为(3.24±0.10)×106 cfu/ml,文库总容量为3.89×107 cfu,平均插入的片段为(2.27±0.15)kb,重组率为95.83%(23/24).结论 构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求,可用于进一步的研究.     

类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库的构建及自身抗原的筛选和鉴定

目的 通过SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression library）技术对类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库进行初步筛选,得到新的类风湿关节炎自身抗原.方法 利用SMART技术构建类风湿关节炎患者滑膜组织cDNA文库,并对该文库进行SEREX筛选,获得特异性结合阳性克隆,对阳性克隆同源性分析.然后进行酶联免疫吸附实验（ELISA）验证,分析该阳性克隆对于类风湿关节炎诊断临床敏感度和特异度.结果 构建cDNA文库滴度约为6.89×10^6 pfu/mL,筛选文库获得12个阳性克隆,同源性分析3个阳性克隆插入片段为已知蛋白,分别是：Filaggrin、SERPINE2和p68.进行血清学初步验证,抗-Filaggrin和抗-SERPINE2具有高敏感度和低特异度,而抗-p68具有高敏感度和高特异度.结论 抗-Filaggrin、抗-SERPINE2和抗-p68对于类风湿关节炎的诊断具有不同的敏感度和特异度.     

Identification of testis development and spermatogenesis-related genes in human and mouse testes using cDNA arrays

We have constructed cDNA microarrays from the human testis large insert cDNA library, containing 9216 genes, together with several housekeeping genes. The cDNA microarrays were used to identify gene expression differences between human fetal and adult testes. Of >8700 hybridized clones, 731 exhibited significant differential expression characteristics. About 7500 genes were identified when the same cDNA microarrays were used for hybridization with cDNA probes from mouse testis, with 256 genes having significant differential expression between the age of 1-4 weeks. Among these genes, 101 were identified as critically related to testis development and possibly to spermatogenesis since they were found in both human and mouse testes, and expressed differentially at different stages of testis development. Of the 101 development-related genes, 59 full-length cDNAs have been sequenced previously, while the full-length cDNAs of the other 42 genes have not been published. We have obtained 11 full-length sequences of the 42 genes and deposited them in the GenBank. The conserved testis development-related genes found in both human and mouse testes may include genes that are likely to be involved in testicular functions, especially spermatogenesis, thus providing a basis for further functional characterization of the genes in mouse models.     

The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes

Collections of full-length nonredundant cDNA clones are critical reagents for functional genomics. The first step toward these resources is the generation and single-pass sequencing of cDNA libraries that contain a high proportion of full-length clones. The first release of the Drosophila Gene Collection Release 1 (DGCr1) was produced from six libraries representing various tissues, developmental stages, and the cultured S2 cell line. Nearly 80,000 random 5' expressed sequence tags (5' expressed sequence tags [ESTs]from these libraries were collapsed into a nonredundant set of 5849 cDNAs, corresponding to ~40% of the 13,474 predicted genes in Drosophila. To obtain cDNA clones representing the remaining genes, we have generated an additional 157,835 5' ESTs from two previously existing and three new libraries. One new library is derived from adult testis, a tissue we previously did not exploit for gene discovery; two new cap-trapped normalized libraries are derived from 0-22-h embryos and adult heads. Taking advantage of the annotated D. melanogaster genome sequence, we clustered the ESTs by aligning them to the genome. Clusters that overlap genes not already represented by cDNA clones in the DGCr1 were analyzed further, and putative full-length clones were selected for inclusion in the new DGC. This second release of the DGC (DGCr2) contains 5061 additional clones, extending the collection to 10,910 cDNAs representing >70% of the predicted genes in Drosophila.     

Gateway非放射标记法构建小鼠破骨细胞前体细胞cDNA文库

背景：作者前期研究发现一个在破骨细胞形成中起关键作用的基因,其在细胞之间相互识别及膜融合中发挥关键作用。 目的：采用Gateway的非放射标记技术构建小鼠破骨细胞早期形成细胞的cDNA基因文库,并检测文库质量。 方法：采集C57BL/6小鼠长骨骨髓,收集贴壁的骨髓单核细胞,加入巨噬细胞集落刺激因子和RANKL诱导形成破骨细胞,在巨噬细胞开始融合至形成破骨细胞的不同阶段开始收集细胞,提取总RNA,用CloneMiner TM cDNA文库构建试剂盒,采用非放射标记方法构建小鼠破骨细胞全长cDNA文库。 结果与结论：构建的小鼠骨髓巨噬细胞cDNA文库滴度为2.15×107 CFU/ mL,库容量为10.5×107 CFU,重组率为100%,重组子插入cDNA平均片段大小约为1.7 kb,范围为0.1~5.8 kb。表明非放射标记法构建同样可以构建小鼠骨髓巨噬细胞全长cDNA质粒文库,避免了放射性物质的接触,且文库质量良好。