大劣按蚊复合体生物学研究现状及展望

大劣按蚊复合体生物学研究现状及展望＊瞿逢伊（第二军医大学寄生虫学教研室，上海２００４３３）大劣按蚊ＡｎｏｐｈｅｌｅｓｄｉｒｕｓＰｅｙｔｏｎｅｔＨａｒｒｉｓｏｎ，１９７９因是东南亚及我国南方的高效传疟媒介而受重视，对其进行的许多研究表明它是由多个形态近...     

大劣按蚊核糖体蛋白S7cDNA克隆

随着多种非哺乳动物的核糖体蛋白相继克隆成功 ,通过同源分析查找核糖体蛋白保守氨基酸序列并推测其功能 ,已成为核糖体蛋白研究的重要手段之一。然而 ,昆虫核糖体蛋白的研究仅仅集中在黑腹果蝇、烟草天蛾和冈比亚按蚊等少数几种昆虫 [1～ 3] 。本实验首次克隆成功东南亚疟疾的重要传播媒介——大劣按蚊 ,核糖体蛋白 S7c DNA,是对昆虫核糖体蛋白研究的重要补充。1　材料与方法1.1　供试蚊虫　大劣按蚊由本教研室长期室内小笼饲养。1.2　试剂　 Tripure TMRNA提取试剂盒 ;RT- PCR试剂 ;sil-ver beads胶回收试剂盒 (均购于上海生物工程…     

大劣按蚊血淋巴中疟原虫感染相关蛋白的cDNA克隆

疟疾是一种严重的传染病,大劣按蚊是我国及东南亚地区的重要传疟媒介。对大劣按蚊抗疟原虫感染分子机制的研究,具有重要意义。我们先前已成功分离了大劣按蚊血淋巴中约氏疟原虫感染相关蛋白(PIRP1),并对该蛋白进行了质谱检测。本研究在已获得PIRP1质谱检测信息的基础上,利用分子生物学技术,成功克隆了该相关蛋白的部分cDNA序列(GenBank序列号为EF409973)。为下一步对该蛋白的功能研究奠定了基础。     

二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐防制大劣按蚊及疟疾的现场研究

１９８９年４月～１９９２年３月在海南万宁县北大乡进行了二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐防疟试验。在现场选择１０个自然村６１２６人为实验区。浸帐前一年进行了流行病学基本数据调查，１９９０年４～５月和１９９１年４月分别用二氯苯醚菊酯５００ｍｇａｉ／ｍ２剂量浸泡蚊帐，浸帐率９８．２％，两次药帐人口覆盖率分别为７３．６％和７３．５％。实验区浸帐前（１９８９年６～１２月）平均月发病率９．９６‰，浸帐后分别降为３．４５‰（１９９０）和２．０７‰（１９９１），比浸帐前同期分别下降６５．４％和７９．２％。其中恶性疟下降尤其迅速而明显。三年试验结果表明，二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐对大劣按蚊自然种群密度及疟疾传播均有明显的防制效果。     

食蟹猴疟原虫B株配子体对中老龄大劣按蚊的感染性

用中老龄（羽化后８．７５—１４．７５和２４．７５日龄）大劣按蚊（海南株）与其４．７５日龄蚊（对照）同时在感染Ｂ株猴疟的同一供血猴上血餐，饱血蚊饲养至第６—８ｄ解剖检查蚊胃、第１２ｄ检查涎腺。结果表明中老龄蚊胃感染率（８５—１００％）与对照（７７—１００％）无显著性差异，涎腺感染率中龄蚊（８３—１００％）与对照（７５—１００％）无显著性差异，胃与涎腺感染率比值中龄蚊（０．９２—１．０）与对照（０．９３—１．０）均很高，中老龄蚊的卵囊均数（７．３—１１５．０）为对照（５．４—８３）的１．Ｏ３—１．５８倍。结果提示Ｂ株猴疟配子体对中老龄大劣按蚊的感染性未下降。感染后的半数存活时间（ＬＴ５０），中龄蚊（１１—１５）比对照（１３—１８）少２—３ｄ。     

对约氏疟原虫不同易感性的大劣按蚊和斯氏按蚊基因组RAPD序列比较

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组RAPD谱带并测序，探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法用已筛选的一条随机引物，随机扩增大劣按蚊和斯氏按蚊成蚊的基因组DNA，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，对相同迁移率的DNA条带克隆、测序，并采用相关在线程序及软件进行序列比较分析。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异，但有4对相同迁移率的条带。序列分析显示4对DNA条带在序列长度和组成上呈现多态性，序列的GC含量和简单重复序列存在差异，序列相似性介于48％～52％之间。结论大劣按蚊和斯氏按蚊之间存在不同的遗传背景，其基因多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关，为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

丝氨酸蛋白酶抑制剂B9与相关免疫细胞

丝氨酸蛋白酶抑制剂B9(Serpin B9)是蛋白酶抑制剂超家族成员,包括人丝氨酸蛋白酶抑制剂(PI-9)及鼠丝氨酸蛋白酶抑制剂同源蛋白(SPI-6),是主要针对颗粒蛋白酶B(GrB)的内源性蛋白酶抑制剂.Serpin B9的调节在T淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞有抑制凋亡、维持细胞平衡、调节免疫反应、增强DNA疫苗能力等功能.研究Serpin B9的作用机理,将有利于相关免疫疾病发生机制的探索,并为临床干细胞治疗、抗肿瘤治疗等提供新的理论依据.     

食蟹猴疟原虫B株子孢子感染后的虫血症及按蚊血餐感染情况

用食蟹猴疟原虫Ｂ株子孢子感染的６只恒河猴，初发期虫血症自然消长曲线２只猴为双峰形、４只猴为多峰形。虫血症显著期（原虫密度≥２‰）最短者为１３ｄ，最长者为３７ｄ。在虫血症显著期供１１３批（１批／日）蚊（大劣按蚊或斯氏按蚊）血餐，获得感染好的蚊虫（卵囊均数＝５－３２７．７，胃感染率＝６５－１００％）５８批、平均为９．７批。感染好的蚊批分布：双峰形的初峰期为１４．２９％（２／１４），次峰期为８５．７１％（１２／１４）；多峰形的初峰、次１和次２峰期分别为２２．７３％（１０／４４）、４５．５％（２０／４４）和３１．８２％（１４／４４）。结果提示对蚊感染性较强的血餐时间主要分布在次１和次２峰期。     

食蟹猴疟原虫B株配子体对大劣按纹感染性的活力周期

用食蟹猴疟原虫Ｂ株早期环状体接种１只恒河猴，接种后第２－１２天（血内仅存在１群原虫）测试了由第１－４代裂殖子形成的４代配子体（Ｇ）对大劣按蚊（海南株）感染性的活力周期。结果表明第１－４代裂殖子均形成了一定数量的Ｇ，由裂殖子发育到Ｇ功能成熟（可使蚊感染）各代有差异，第２代Ｇ至少需５５±１ｈ，第３代Ｇ则需６５±１ｈ；发育至７２±４ｈ时活力最旺，Ｇ寿命长者可达１００ｈ；生活期（对蚊有感染力的时间）第１、２代Ｇ约为１２－４２ｈ，第３代Ｇ约为１０－１９ｈ。Ｇ密度与蚊胃卵囊均数不成正比，第１、２代Ｇ对蚊的感染性比第３、４代强     

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2的研究进展

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)是补体凝集素途径关键酶,位于染色体1p36上,约20 kb,由686个氨基酸残基构成。通过病原相关分子模式识别病原体,与凝集素结合,以酶原形式存在的MASP-2活化,继而激活后续级联反应,致使入侵的病原体被机体清除破坏。MASP-2基因多态性普遍存在,过高或过低的MASP-2水平都不利于免疫系统正常运行,影响着多种疾病的易感性及发展进程。MASP-2血清浓度在不同疾病及同一疾病不同阶段的不尽相同。MASP-2与肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的发生发展密切相关。     

Lack of Association Between Genetic Variation in 9 Innate Immunity Genes and Baseline CRP Levels

It is well‐known that baseline levels of C‐reactive protein (CRP) are an independent cardiovascular risk factor. We hypothesized that genetic variation with significant influence on CRP levels might be found in genes of the innate immunity system. We performed a candidate gene association study examining common single nucleotide polymorphisms in 9 innate immunity genes (CARD15, IRAK1, IRAK4, LBP, LY86, MEFV, TLR2, TLR4 and NFKB1) in relation to CRP levels. Seven hundred and seventeen subjects from the Women's Health Study population were studied: 359 and 358 samples with extremely low (<0.2 mg/liter) and high (>5 mg/liter) CRP levels, respectively. SNPs were identified from publicly available resequencing data, using a minor allele frequency threshold of >5% and a linkage disequilibrium (LD)‐based strategy (r² > 0.8) to select 63 LD‐independent markers. One non‐synonymous SNP in TLR4 and two non‐synonymous SNPs in CARD15, previously associated with atherosclerosis and Crohn's disease, respectively, were also studied. Univariate, haplotype and gene‐gene interaction analyses all indicated no significant association with CRP levels. Although this work excludes a significant association of common SNPs in these nine genes with CRP levels, it is possible that rarer alleles in these genes, or variation in other innate immunity genes, could be associated with variation in CRP.     

广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度的比较

目的比较广东省嗜人按蚊与中华按蚊疟疾传播强度，为控制疟疾爆发流行提供科学依据。方法采用按蚊密度调查等方法在广东省珠海市和惠州市进行媒介能量的调查和研究。结果广东省珠海市嗜人按蚊的媒介能量为5．863，中华按蚊为0．663；广东省惠州市嗜人按蚊的媒介能量为2．770，中华按蚊为0．249。结论嗜人按蚊的媒介能量是中华按蚊的8～11倍，说明嗜人按蚊在广东的传疟作用较中华按蚊更为重要，占主要地位。     

嗜人按蚊rDNA—ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA（rDNA）第2内转录间隔区（ITS2）序列，研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性（Single Nuclear Polymorphism，SNP）。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板，利用蚊虫5．8s和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因，扩增产物经回收纯化后连接到TA载体，经amp^＋LB固体平板筛选的阳性克隆。经amp^＋LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因。纯化后重组克隆经PCB鉴定可重现556bp的特异性条带，其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99．6％，其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入，在556的范围内有一个A→T，一个G→T的颠换；一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守，但不同个体间也存在一定的SNP多态性。     

应用抑制性消减杂交技术筛选及鉴定高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因

目的克隆高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因，探讨其分子生物学机理。方法应用抑制性消减杂交技术构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库；联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选阳性克隆进行测序和同源性分析；用Northern印迹方法证实这些基因的表达。结果成功构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库，从中筛选到15个基因，均与GenBank中已知基因有同源性。Northern印迹证实这些基因在高温致畸胚胎神经管中均呈下调表达。结论发现了高温致金黄地鼠神经管畸形过程中的一些重要相关基因并对其功能进行了初步探讨。     

小鼠生发泡完整卵母细胞一个特异基因的克隆及其在胚胎的表达

目的：克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(Gv卵)特异基因,并检测其一在胚胎中的表达。方法：应用抑制性消减杂交技术(SSH),建立Gv卵特异的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选并对阳性克隆进行序列测定和同源性分析;采用RT-PC方法观察其一在着床前胚胎的表达。结果：克隆发现18个基因和8个EST序列在GV卵中特异表达。RT-PCR显示该阳性克隆的基因在GV卵、MII卵、1-细胞胚胎和2-细胞胚胎有表达,其短片段是预期要扩增者,从MII卵开始表达下降;长片段在Gv卵、MII卵、1．细胞胚胎和2-细胞胚胎表达未见明显变化。长、短片段两端序列一致。结论：该基因是GV卵特异cDNA文库中的一个基因,且是母源性基因,提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。     

抑制性消减杂交应用的研究进展

抑制性消减杂交是一种简便易行、特异性高的高效分离差异表达基因的方法。该技术应用于肿瘤、干细胞等方面的研究已取得重要进展。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg蛋白结合蛋白E36的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBeAg蛋白结合蛋白HBEBP36(E36),为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆E36蛋白反式激活的靶基因。方法E36基因表达质粒pcDNA3·1/myc-his(A)(-)-E36转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3·1/myc-his(A)(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-TEasy载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选30个克隆进行测序及同源性分析。结果成功构建人E36基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。随机挑选的30个克隆测序后得到27个序列,它们代表17种编码基因,包括ATP合酶、ADP/ATP转运体、NADH脱氢酶、乳酸脱氢酶、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S21、核糖体蛋白L2、胰岛素样生长因子结合蛋白6、甲基转移酶类似物7A、CD46抗原、间质抗原2、转录激活因子4、真核转录延伸因子1α、人微管蛋白α、肌动蛋白α,和2个未知片段。结论E36上调HepG2细胞中的17种基因,它们参与能量代谢、蛋白合成、免疫功能调节等生理过程。