血脑屏障体外实验模型的建立

目的:应用培养的CBA/J小鼠脑血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC)构建血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的体外实验模型.方法:将BMVEC种植在明胶包被的24孔板细胞插入器的微孔滤膜上培养至汇合状态,通过4 h液面渗漏实验、扫描和透射电镜、血脑屏障形成前后膜两侧的电阻以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的通透性和RMP-7对血脑屏障通透性的调控作用来证实BBB的形成.结果:BMVEC培养至汇合后,4 h液面渗漏实验成为阳性;扫描电镜显示细胞形成单层,透射电镜证实细胞间形成紧密连接;跨细胞电阻(the transendothelial electrical resistance,TEER)分别为汇合前和人脐静脉内皮细胞的3.2倍和7.7倍;对HRP的通透率分别为前对照组的13.4%和6.7%;RMP-7处理使HRP在BBB的通透率增加了2.7倍.结论:构建的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性,适用于中枢神经系统药物跨BBB能力的研究.     

高温对血脑屏障内皮细胞紧密连接的影响

目的探讨高温对血脑屏障内皮细胞间紧密连接的影响及其分子机制。方法利用内皮细胞与胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。采用Millicell-ERS系统检测血脑屏障模型的跨内皮阻抗(transendothelial resistance, TER)。对内皮细胞间紧密连接采用银染的方法研究其结构的完整性。运用半定量RT-PCR的方法分析高温作用后血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白zonula occluden 1(ZO-1)的表达变化。结果43 ℃作用2 h后,体外血脑屏障模型TER均值由(321.30±58.59)Ω·cm2下降至(65.67±6.02)Ω·cm2。同时,内皮细胞紧密连接的银染显示,内皮细胞紧密连接完整性明显破坏。RT-PCR分析结果显示,高温条件下体外血脑屏障模型中内皮细胞ZO-1的表达水平明显降低。结论高温可以明显破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接的完整性,高温条件下内皮细胞ZO-1表达水平的降低是血脑屏障热损伤的重要分子机制。     

内毒素脂多糖对体外血脑屏障模型通透性的影响及其机制研究

感染性脑损伤时血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性增加在血管源性脑水肿发生发展中起重要作用，因此，阐明感染性脑损伤时BBB通透性改变及其调控机制具有十分重要的临床意义。本研究利用同种属的星型胶质细胞（astrocytes，AS）与脑微血管内皮细胞（bain microvascular endothelial cell，BMEC）共同培养，建立体外BBB模型，探讨BBB紧密连接蛋白和细胞骨架肌动蛋白（actin）在内毒素脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）诱导的BBB通透性增高中的变化及其与Rho／Rho激酶细胞信号转导通路的关系。对这一问题的深入探讨，有助于进一步阐明感染性脑损伤的发病机制，为其临床防治提供新的思路。     

体外血脑屏障模型的建立

目的:利用自发转化的人脐静脉内皮细胞系ECV304和分离纯化的大鼠星形胶质细胞共培养试图建立一种具有重复性好、细胞纯度高、培养操作简便、接近在体状态的体外血脑屏障模型。方法:分3步:(1)分离纯化培养大鼠星形胶质细胞;(2)建立体外血脑屏障BBB模型(内皮细胞系/星形胶质细胞非接触共培养);(3)模型鉴定。结果:利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立的血脑屏障模型无论是在形态学、屏障功能上还是内皮细胞的特异性标志物的表达水平上都与在体血脑屏障的特性相似。结论:可以利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

双重介导脑靶向脂质体增强荷载阿霉素的体外血-脑脊液屏障渗透率

目的 探讨双重介导脑靶向脂质体(RVGPR9-SSL)作为递送载体对阿霉素(doxorubicin, DOX)血-脑脊液屏障(blood brain barrier, BBB)渗透率的影响,为脑部药物递送提供新的策略。方法 利用前期构建的双重介导脑靶向脂质体(RVGPR9-SSL)作为载体包载DOX(DOX@RVGPR9-SSL)。培养脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMVEC),在体外构建BBB模型,通过4h渗漏实验、跨膜电阻值(transmembrane resistance value, TEER)测量、扫描透射电镜(scanning transmission electron microscope, SEM)观察细胞间的紧密连接等,鉴定体外BBB模型构建是否成功。在BBB模型构建成功后,利用荧光共振能量转移(fluorescence a resonance energy transfer, FRET),通过激光共聚焦显微镜,考察RVGPR9-SSL体跨越BBB后的完整性。通过对比分析脂质体给药前后,BBB的形态以及TEER值,考察RVGPR9-SSL跨越BBB后对BBB完整性的影响。通过荧光分光光度计,考察DOX@RVGPR9-SSL的BBB渗透率。结果 RVGPR9-SSL的包封率为97.25％。构建的BBB模型的TEER值均>200Ω·cm²,并通过SEM观察到BMVEC细胞排列紧密,存在着明显的紧密连接,说明体外BBB模型成功建立,可用于考察BBB渗透率。DOX@RVGPR9-SSL4h累积BBB渗透率>10%,显著高于游离DOX的4h累积BBB渗透率。给药后BBB与DOX@RVGPR9-SSL均能保持较好的完整性。结论 RVGPR9-SSL可以显著提高所包载的DOX的BBB渗透率,并且具有较好的安全性,是非常有前景的脑部药物递送载体。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性的研究

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　在成功建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性模型的基础上 ,研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果　①耳蜗微血管内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118 9± 18 5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,其通透性呈上升期抛物线型曲线 ,90min内几乎呈直线。结论　跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线能反映体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征     

M1表型的小胶质细胞外泌体对血脑屏障功能的影响

目的 研究M1表型的小胶质细胞外泌体（M1 microglia-derived exosome,M1-exo）对体外血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）功能及血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响。方法 用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小鼠小胶质细胞来源的细胞系BV2细胞,流式技术检测其向M1型极化情况,分离提取外泌体。用小鼠脑微血管内皮细胞系b.End3细胞与原代培养的小鼠星形胶质细胞构建体外BBB模型,随机分为3组：b.End3细胞正常培养组（b.End3组）、b.End3细胞+25 μg/mL正常BV2细胞来源外泌体（BV2-derived exosome,BV2-exo）组（b.End3+BV2-exo组）、b.End3细胞+25 μg/mL M1表型的小胶质细胞来源外泌体组（b.End3+M1-exo组）。按实验分组将不同来源外泌体与BBB模型共培养,检测各组的跨膜电阻（trans-endothelial electrical resistance,TEER）、荧光黄通过率,免疫印迹法（Western blot,WB）检测紧密连接复合物蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM蛋白的表达。结果 ①小胶质细胞向M1型极化成功,其细胞标志物CD16/32阳性率较对照组明显升高（P=0.023）;②与M1-exo共培养后,体外BBB模型的TEER明显下降（P=0.000）,对荧光黄的透过率明显增加（P=0.000）;③与b.End3组和b.End3 + BV2-exo组相比,b.End3+M1-exo组的Claudin-1、Occludin及ZO-1蛋白的表达水平明显下降。结论 M1-exo可以破坏BBB的完整性,影响其功能。     

血脑屏障体外模型的建立与评价

血脑屏障由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞（astrocyte,As）足突、基底膜及周皮细胞组成.脑微血管内皮细胞是BBB主要结构基础,As对维持BBB的完整性起重要作用].本研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与小鼠As共培养构建BBB体外模型,并对其形态及屏障功能进行鉴定,以期成为体外研究物质（包括药物）经BBB通透的一种简便而可靠的工具.     

槲皮素对血脑屏障的透过及胶质瘤U251细胞活性的影响

目的 研究槲皮素对血脑屏障(BBB)透过情况及对人胶质母细胞瘤U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 原代培养脑微血管内皮细胞(BMVEC)和星形胶质细胞(AC),建立BBB体外模型,通过电子显微镜和跨膜电阻值(TEER)测量验证BBB模型,采用高效液相色谱(HPLC)检测槲皮素透过血脑屏障的情况.槲皮素处理U251细胞,用MTT观察细胞的生长、TUNEL检测细胞凋亡、彗星电泳(SCGE)分析DNA损伤及流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布情况.结果 透射电镜及TEER鉴定BBB体外模型构建成功,HPLC检测发现槲皮素对血脑屏障的透过率达到65.54%.槲皮素对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用,流式细胞仪检测提示槲皮素作用后,U251细胞阻滞于G2/M期.结论 槲皮素可有效透过BBB,并对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用.     

Detrimental Effect of Electromagnetic Pulse Exposure on Permeability of In Vitro Blood-brain-barrier Model

Objective To study the effect of electromagnetic pulse (EMP) exposure on permeability of in vitro blood-brain-barrier (BBB) model. Methods An in vitro BBB model, established by co-culturing brain microvascular endothelial cells (BMVEC) and astroglial cells (AC) isolated from rat brain, was exposed to EMP at 100 kV/m and 400 kV/m, respectively. Permeability of the model was assayed by measuring the transendothelial electrical resistance (TEER) and the horseradish peroxidase (HRP) transmission at different time points. Levels of BBB tight junction-related proteins were measured at 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h after EMP exposure by Western blotting. Results The TEER level was lower in BBB model group than in control group at 12 h after EMP, exposure which returned to its normal level at 24 h. The 24 h recovery process was triphasic and biphasic respectively after EMP exposure at 100 kV/m and 400 kV/m. Following exposure to 400 kV/m EMP, the HRP permeability increased at 1-12 h and returned to its normal level at 24 h. Western blotting showed that the claudin-5 and ZO-1 protein levels were changed after EMP exposure. Conclusion EMP exposure at 100 kV/m and 400 kV/m can increase the permeability of in vitro BBB model and BBB tight junction-related proteins such as ZO-1 and claudin-5 may change EMP-induced BBB permeability.     

BALB/c荧光裸鼠脾脏组织学的观察

目的 探讨不同日龄阶段BALB/c荧光裸鼠脾脏组织学变化;以及与BALB/c普通裸鼠脾脏组织学的差异。 方法 取不同日龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）BALB/c荧光裸鼠及BALB/c普通裸鼠各32只,雌雄各半,处死取脾脏,对脾脏的绝对重量、脾脏指数进行测量分析,对脾脏的组织学改变进行观察,并对脾脏淋巴细胞数进行统计分析。 结果 与14日龄荧光裸鼠相比,28日龄荧光裸鼠脾脏指数明显较高（p<0.05）。与14日龄荧光裸鼠相比,49日龄、70日龄荧光裸鼠淋巴细胞数明显变少（p<0.05）。与普通裸鼠（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）相比较,相同日龄荧光裸鼠（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）淋巴细胞数明显减少（p<0.05）。 结论 GFP基因对不同日龄荧光裸鼠的脾脏发育及其功能有一定影响。     

Attenuation of GVHD for allo-bone marrow transplantation recipient by fasL-fas pathway in an H-2 haplotype disparate mouse combination

Fas (CD95 ) ,atypeⅠtransmembraneproteinoftumornecrosisfactor (TNF)andtumorgrowthfactor (TGF )receptorfamily ,isexpressedonavari etyofhumanorgansandsometumorcellsbesidesac tivatedmatureTcellsandlymphocytestransducedbyhumanTlymphocytevirus (HTLV ) ,humanim…     

裸小鼠淋巴结的解剖和组织学特点

目的 研究裸小鼠淋巴结的解剖学和组织学特点。方法 使用手术显微镜解剖20只BALB/c裸小鼠和20只BALB/c小鼠,通过免疫组织化学方法比较了两者淋巴结中T淋巴细胞和B淋巴细胞表达的不同。结果 平均每只裸小鼠中包含23个淋巴结和一组大型淋巴结群。裸小鼠颈部淋巴结分布密度较高,其中颌下淋巴结及颈浅淋巴结在裸小鼠中大多数为2个(构成比分别为95%和90%),而在小鼠中大多数为4个(构成比分别为95%和90%),两者差异有统计学意义。无论小鼠还是裸小鼠的颈深淋巴结均为2个(构成比分别为100%和95%),两者差异无统计学意义。裸小鼠淋巴结中CD₃阳性的T淋巴细胞减少。细胞膜和细胞质着色的CD₃阳性表达的T细胞在裸小鼠的表达阳性率为15%,在小鼠的表达阳性率为100%,两者表达的差异有统计学意义。细胞膜阳性表达CD₂₀的B细胞在裸小鼠中的阳性率为95%,在小鼠中的阳性率为100%,两者表达的差异无统计学意义。结论 裸小鼠淋巴结分布的解剖图对于初学者有一定的帮助,裸小鼠颈部淋巴结密度较高的解剖学特点和缺乏CD₃阳性的T淋巴细胞将有助于更好地理解裸小鼠的淋巴结转移机制。     

曲古抑菌素A对小鼠混合淋巴细胞培养中淋巴细胞增殖和IL-2表达的影响

目的 研究曲古抑菌素A(TSA)对小鼠体外混合淋巴细胞培养中淋巴细胞增殖及IL-2表达的影响,探讨TSA对T细胞免疫功能的影响.方法 采用0.16、0.8、4、20、100、500 nmol/L倍比浓度TSA作用于BALB/c及C57BL小鼠混合淋巴细胞培养体系.根据不同的OD值测定12、24、48 h各浓度TSA对T淋巴细胞增殖的抑制率;相同浓度梯度TSA再作用于经丝裂霉素处理过的BALB/c淋巴细胞与C57BL淋巴细胞单向混合淋巴细胞培养体系,以环磷酰胺作对照,应用流式细胞技术观察其对IL-2表达的影响.结果 TSA可以抑制小鼠混合淋巴细胞培养中T淋巴细胞的增殖,这种抑制能力表现出明显的量效及时效依赖性;TSA也显著抑制经刺激激活的小鼠T淋巴细胞的IL-2的表达,并且随着TSA浓度的升高,IL-2表达逐步下降.但与CTX比较有显著性差异(P<0.01).结论 TSA能抑制混合淋巴细胞培养中淋巴细胞的增殖.减少激活T淋巴细胞IL-2的表达,降低T细胞的免疫活性,能够减弱对外来抗原刺激的免疫应答.     

持久稳定的大鼠→小鼠造血嵌合体模型的建立

目的：建立持久稳定的造血嵌合体模型．方法：将预处理后的SD大鼠经尾静脉注射BALB／c小鼠骨髓细胞,诱导形成特异性耐受的嵌合体SD大鼠．30d岳,再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给致死性照射后的BALB／c小鼠,监测小鼠的存活率,移植后30d做皮片移植和混合淋巴细胞培养,观察小鼠嵌合率的变化．结果：嵌合体模型小鼠仅有轻度移植物抗宿主病的表现,生存期明显延长,移植后嵌合率较稳定,移植皮片存活期延长,与对照组相比有显著性差异．结论：通过输入嵌合体骨髓的方法可建立稳定持久的大鼠→小鼠嵌合体模型．     

鼠李糖乳杆菌培养上清液通过抑制NF-κB通路预防大肠杆菌性脑膜炎

目的：体外探讨鼠李糖乳杆菌上清液(LGG-CM)能否通过抑制NF-κB通路来阻断大肠杆菌K1（E. coli K1）株引起的细菌性脑膜炎。方法用人脑微血管内皮细胞（HBMEC）构建体外血脑屏障模型;采用免疫印迹研究LGG-CM能否抑制E. coli K1激活NF-κB通路;通过侵袭实验和中性粒细胞迁移实验,研究LGG-CM能否抑制细菌侵袭和中性粒细胞迁移;通过免疫印迹研究黏附分子CD44和紧密连接蛋白ZO-1的表达;免疫荧光检测ZO-1蛋白的细胞内分布;用Transwell建立体外血脑屏障模型,通过跨细胞内皮电阻（TEER）值和细菌迁移实验评价LGG-CM对细胞屏障完整性的保护作用。结果免疫印迹结果表明LGG-CM能抑制E. coli K1激活NF-κB通路,藉此抑制E. coli K1的侵袭和中性粒细胞迁移。同时,LGG-CM可抑制E. coli K1上调CD44蛋白和下调紧密连接蛋白ZO-1。此外,LGG-CM能够明显减缓TEER值的降低和抑制E. coli K1穿越体外血脑屏障。结论体外实验表明,LGG-CM能够通过抑制NF-κB通路激活、阻断E. coli K1侵袭和中性粒细胞迁移及维护血脑屏障完整性来预防E. coli K1引起的细菌性脑炎。     

阿司匹林降低肺癌脑转移及其可能机制研究

目的 明确前列腺素E2(PGE2)在肺癌脑转移过程中的作用,并探讨阿司匹林（PGE2抑制剂）降低肺癌脑转移的可能机制。方法 体外细胞培养,放射免疫法测定给予阿司匹林(8 mmol/L)后不同时间点肺癌细胞培养液中PGE2质量浓度的变化;将肺癌细胞和阿司匹林(8 mmol/L)加入Transwell构建的体外血脑屏障模型上室后,Western blot法动态检测脑微血管内皮细胞内occludin蛋白的表达水平;通过辣根过氧化物酶检测体外血脑屏障模型的通透性改变,Hemocytometer法计数通过体外血脑屏障模型的肺癌细胞数。建立肺癌脑转移动物模型,观察阿司匹林对裸小鼠肺癌脑转移发生率的影响。结果 在细胞水平上研究发现,给予阿司匹林后,肺癌细胞培养液内PGE2质量浓度降低,于阿司匹林作用120 min时降至最低。模型中脑微血管内皮细胞occludin蛋白的表达于阿司匹林作用后增加,且于阿司匹林作用120 min时增加程度最大。与此同时,模型中血脑屏障通透性和肺癌细胞透过血脑屏障的数量亦于给予阿司匹林120 min时降至最低值。动物模型观察发现,阿司匹林可以明显降低肺癌脑转移的发生率（ P<0.05）。结论 阿司匹林可以降低肺癌脑转移的发生,其作用机制可能为阿司匹林抑制肺癌细胞释放PGE2,进而上调紧密连接蛋白occludin的表达,从而降低了血脑屏障的通透性。     

自制扩散匣的免疫隔离作用及匣内异基因瘤细胞的在体生长观察

目的 观察自制细胞扩散匣的免疫隔离作用及匣内异基因瘤细胞的在体生长情况。方法 通过PEG介导制备SP2/0-BALB／c小鼠脾细胞杂交细胞。注入BALB／c小鼠和C57BL／6(B6)小鼠腹腔，观察腹水产生和瘤体形成，了解杂交细胞MHC抗原携带情况。再将含杂交细胞的微孔膜扩散匣分别植入BALB／c和B6小鼠腹腔，观察匣内细胞生存情况。结果 腹腔注射杂交细胞后2个月内，BALB／c小鼠产生血性腹水，或形成瘤体，B6小鼠未见腹水产生和瘤体形成。腹腔植入杂交瘤细胞扩散匣后30d和101d，两组动物体内扩散匣均被大网膜或肠系膜包裹，外壁可见新生血管，匣内形成瘤体，但不能充满整个匣腔。结论 SP2／0细胞与BALB／c小鼠脾细胞融合后可转变为携带BALB／c品系MHC抗原的永生细胞，在异基因宿主(B6小鼠)体内不能存活。自制微孔膜扩散匣能有效起到免疫隔离作用。微孔膜外表面能够形成新的营养血管，支持匣内细胞长期生存与增殖。