脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

姜黄素对人脂肪组织脂联素分泌的影响

目的探讨在体外培养条件下不同浓度姜黄素干预对内脏脂肪组织与腹部皮下脂肪组织脂联素（APN）分泌的影响。方法用体外组织培养法培养手术中离体脂肪组织（n=84），分别予低浓度姜黄素（10μg·mL^-1）和高浓度姜黄素（100μg·mL^-1）干预不同时间，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定干预前后组织培养液中APN的含量。结果与对照组相比，在姜黄素浓度为100μg·mL^-1干预下，内脏及腹部皮下脂肪组织APN分泌均有明显增加（P〈0．05），干预浓度为10μg·mL^-1时对脂肪组织APN分泌无明显影响（P〉0．05）；且基础状态下体外培养6h和24h时，腹部皮下脂肪比内脏脂肪APN分泌分别升高28．79％、19．76％。结论姜黄素干预脂肪组织可使APN分泌增加，而且与剂量有关。     

小鼠脂肪组织脂联素基因编码区的克隆及序列分析

目的：克隆小鼠脂肪组织脂联素（ACRP30）编码区基因并进行序列分析。方法：用TRIzol试剂从小鼠脂肪组织提取总RNA，经RT-CR方法扩增全长的ACRP30 cDNA片段，将PCR产物克隆于pGEM-T载体，对重组质粒pGEM-ACRP30进行序列验证。结果：小鼠脂肪组织ACRP30基因编码序列不同于来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列．IRM-2（Institute of Radimion Medicine-2）小鼠和C57BL／6J小鼠脂肪组织的ACRP30基因编码序列相同。337位点上的碱基A被G置换导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代。来自脂肪组织的ACR30基因编码序列已被提交到GenBank^TM数据库。C57BL／6J小鼠的收录编号为AY749429。IRM-2小鼠为AY754346。结论：小鼠脂肪组织ACRP30编码序列是ACRP30序列的新成员，cDNA克隆的构建为进一步的蛋白表达和生物学活性研究奠定了基础。     

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

脂联素的研究进展

本文综述了脂联素的结构、生理功能、影响因素，以及与脂联素功能失调相关的疾病。     

咖啡豆提取物对肥胖大鼠血清瘦素、脂联素水平及脂联素受体表达水平的影响

目的 研究咖啡豆提取物对高脂饮食肥胖大鼠的瘦素(Leptin,LP)、脂联素(APN)及脂联素受体表达的影响。方法 给予高脂饲料建立SD大鼠肥胖模型,灌胃给予咖啡豆提取物(800,267,133 mg·kg^-1),连续6周。测量大鼠体质量及脂体比,测定大鼠血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、血清LP、APN;检测肝组织脂联素受体表达。结果 与正常对照组相比,给予高脂饲料6周的大鼠体质量明显增加(P<0.01),提示SD大鼠肥胖模型建立。与模型组比较,咖啡豆提取物给药后大鼠体质量、脂体比和LP水平下降(P<0.01或P<0.05),血清APN水平、APN受体的mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01或P<0.05)。结论 咖啡豆提取物对高脂饮食肥胖大鼠的体质量具有改善作用,作用机制可能是升高血清APN水平,降低LP水平及上调肝脏脂联素受体的mRNA和蛋白表达。     

脂联素干预TNF-α作用后的巨噬细胞脂联素受体mRNA表达水平及其吞噬脂质变化

目的探讨脂联素干预TNF-α作用后的巨噬细胞表面脂联素受体mRNA表达水平及其吞噬脂质的变化。方法单核巨噬细胞系用佛波酯诱导,使之分化为巨噬细胞;进而采用不同浓度的TNF-α(0、0.1、1、10、100ng/ml)作用24h(以TNF-α0ng/ml为空白对照组),采用RT-PCR技术观察巨噬细胞表面脂联素受体R1、R2mRNA表达水平。选择0、10ng/ml浓度TNF-α作用后的巨噬细胞,用0.2mg/ml低密度脂蛋白混悬生长液作用24h,油红O染色和比色定量检测巨噬细胞吞噬脂质变化;同时TNF-α作用后的巨噬细胞,进一步用人重组脂联素20μg/ml干预24h,再次观察巨噬细胞表达脂联素受体mRNA水平及吞噬脂质变化。结果巨噬细胞用不同浓度的TNF-α作用后,随着TNF-α浓度梯度增加,脂联素受体R1、R2mRNA表达水平逐渐下降(P<0.05)。TNF-α10ng/ml作用后的巨噬细胞吞噬脂质的量明显高于TNF-α空白对照组(P<0.05);同时10ng/mlTNF-α作用后的巨噬细胞,进一步用脂联素干预,巨噬细胞表达脂联素受体R1、R2mRNA水平均较干预前上调(P<0.05),吞噬脂质的量较干预前减少(P<0.05)。结论脂联素及其受体在调节巨噬细胞吞噬脂质过程中产生重要作用,该作用可能成为预防和治疗动脉粥样硬化发生发展的新靶标。     

缬沙坦对肝纤维化大鼠脂联素及脂联素受体2表达的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂缬沙坦对肝纤维化大鼠脂联素(ADN)及ADN受体2(AND-R2)表达的影响。方法选36只雄性Wistar大鼠分为对照组、模型组、药物组,用四氯化碳(CCl4)背部皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型,药物组于造模开始每只大鼠缬沙坦灌胃(30 mg·kg-1·d-1),8周末处死。肝组织苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色,进行肝纤维化分期。酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清ADN、肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子-β1(TGF-β1)的浓度,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝组织中ADNm RNA(ADN-R2)m RNA水平,蛋白印迹法检测肝脏ADN、ADN-R2、Ⅰ型胶原表达水平。结果 (1)模型组大鼠造模成功,药物组肝组织纤维化程度较模型组明显减轻;(2)模型组较对照组血清脂联素水平降低,TNF-α、TGF-β1水平增高(P<0.01),药物组较模型组ADN增高(P<0.01)、TNF-α和TGF-β1水平下降(P<0.01或<0.05);(3)肝脏ADN和ADN-R2m RNA水平模型组较对照组明显下降(P<0.01),药物组较模型组增高(P<0.05);(4)模型组较对照组ADN、ADN-R2蛋白表达减少,Ⅰ型胶原蛋白增高(P<0.01),药物组较模型组ADN蛋白表达增高(P<0.01),ADNR2蛋白表达增高(P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白下降(P<0.05)。结论血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦可能通过增高大鼠ADN、ADN-R2的表达,减少TNF-α、TGF-β1水平,减轻肝脏炎症,发挥抗肝纤维化作用。     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析

目的：克隆Survivin基因的cDNA，为分子信标定量检测其mRNA提供模板标准物。方法：以国人胎脾为材料提取总RNA作为模板，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增并克隆Survivin cDNA，并将其重组到pUCl8质粒中，用双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：克隆的Survivin cDNA序列与Gene Bank中的该基因序列相比较仅有1个碱基出现差别，并导致编码相应氨基酸的改变。结论：成功构建了Survivin基因的cDNA克隆，为建立Survivin基因mRNA的定量检测方法奠定了基础。     

粉尘螨2类变应原基因的克隆和序列分析

目的:克隆中国大陆地区粉尘螨2类变应原(Derf2)的cDNA。方法:挑取活的粉尘螨经-70℃冷冻后提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Derf2基因,克隆至pMD18-TSimple平滑载体中测序。结果:筛选出2株长度为436bp的Derf2cDNA片段,核苷酸序列1株与Genbank上的Derf2序列(D10448)碱基有6处不同,同源性为98.6%;另1株有2处不同,同源性为99.7%。结论:粉尘螨2类变应原的基因序列具有多态性,中国大陆地区Derf2的cDNA克隆片段与Genbank上公布的Derf2序列高度同源。     

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

人细胞色素P450 1A2 cDNA克隆及鉴定

为建立人细胞色素 P450转基因细胞 ,从人肝组织提取总 RNA,RT- PCR扩增人细胞色素 P4501 A2基因的 c DNA( CYP1 A2 c DNA) ,将其连接到p GEM- T载体上 ,并对 CYP1 A2 c DNA进行全序列测定 .结果与 Jaiswal等发表的 CYP1 A2 c DNA序列相比 ,所克隆的 c DNA,codon51 5AAT→ AAC都编码天冬酰胺 ,而 codon 51 0后面插入了一个CTG(亮氨酸 ) ,则与 Quattrochi等报道的相同 .本实验室克隆的 CYP1 A2 c DNA可能是一种新的CYP1 A2 c DNA,有可能来自于一种新的 CYP1 A2等位基因的转录 .     

突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达

目的：通过基因工程的方法将ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ基因改造以得到更加稳定的酶。方法：以本实验室构建的 ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ为模板,利用含有突变核苷酸的引物进行 ＰＣＲ扩增,将正确测定的含 ｒｈＣｕ, Ｚｎ－ＳＯＤ突变（ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ）基因的重组质粒重组到表达载体ＰＥＴ－２２ｂ（＋）中,重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ。结果：表达产物占菌体总蛋白的３８％,具有特异性ＳＯＤ酶活性。结论：从基因突变的角度改善酶的性能不仅具有理论意义,又有一定的实用价值。     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

一种新的小鼠Gabarap12 cDNA的克隆和鉴定(英文)

目的:克隆一个新的小鼠GABA_A受体相关蛋白相似蛋白2基因(Gabarapl2),并对其功能进行初步分析。方法:将已知的人GABARAPL2 cDNA序列为信息探针筛选GenBank小鼠EST数据库,将获得的一系列互相重叠的同源度较高的EST序列进行拼接。经过实验验证,在小鼠中分离和鉴定了新基因。自行制备小鼠RNA印迹膜,用杂交方法分析该基因在不同组织中的表达情况。结果:新基因在GenBank注册,登录号AF190644。同源比较显示,该推导蛋白与人GABARAPL2基因编码的蛋白完全相同,被基因命名委员会命名为小鼠Gabarapl2。该基因的推导蛋白含多个蛋白激酶磷酸化位点。杂交显示,该基因在脑、胸腺等组织表达较高,转录本大小约1.35kb。结论:克隆到一个新的小鼠Gabarapl2基因。     

人胎脑中干扰素诱导基因1—8家族cDNA的克隆

研究干扰素及干扰素诱导蛋白的基因表达在脑发育中的变化,（１）利用基因工程技术克隆了诱导蛋白１－８家族基因,主要步骤为自未经干扰素处理的胎脑中提取总ＲＮＡ,经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－纤维系柱分离纯化出ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ。（２）用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出干扰素诱导的１－８基因家族成员保守区的ｃＤＮＡ片段,即已知的３个成员,１－８Ｕ,１－８Ｄ和９－２７的同源序列,将此扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＵＣ１８的Ｓｍ