LRP16基因启动子的亚克隆及表达调控载体的构建

目的：为深入研究LRP16基因的表达调控机制，克隆及亚克隆了LRP16基因的启动子序列，构建LRP16基因启动子表达调控载体。方法：在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRPl6基因转录起始位点5′侧翼区约3kb的基因组序列设计PCR扩增引物，从健康外周血中扩增获得该片段，以此序列为基础进行亚克隆，分别获得6条5’端不等、3’端平齐的片段，最后插入用于表达调控研究的pGL3—Basic载体。结果：获得了7条长度依次差别约为400bp的LRP16启动子克隆，分别构建了调控荧光素两报告基因的真核表达载体。结论：上述载体的成功构建为信息资源与实验手段的有效结合克隆启动子序列提出了一种模式，并为LRPl6表达克隆及启动子的活性分析奠定了基础。     

小鼠LRP16基因同源重组ES细胞克隆的鉴定

目的:为深入研究LRP16基因的生理功能,本研究将小鼠LRP16基因特异打靶载体pBΔ16转染小鼠胚胎干细胞(embryon ic stem cell),并筛选同源重组克隆。方法:通过电转染方法将LRP16插入失活型打靶载体导入ES细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,Southern b lot方法鉴定同源重组ES细胞克隆。结果:打靶载体成功转染ES细胞,Southern b lot筛选100个抗性克隆,结果显示有一个打靶序列同源重组型插入的ES细胞克隆。结论:筛选到同源重组型ES细胞,为下一步建立LRP16缺失型小鼠并为从整体水平研究LRP16基因的生理功能奠定基础。     

LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化中表达量的变化

目的 LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达量的变化及胰岛素对脂肪细胞LRP16蛋白表达的调控。方法经典脂肪细胞诱导方案诱导前脂肪细胞为成熟脂肪细胞,每天（0-8d）均留取蛋白标本。不同浓度（0、1、10、100nmol/L）胰岛素刺激脂肪细胞24h,分别留取蛋白标本。Western-Blot方法检测样本中LRP16蛋白的表达量。结果 LRP16蛋白在前脂肪细胞无表达或极低表达,从诱导的第3、4天开始表达,迅速升至高峰,此后维持在高表达水平。LRP16蛋白在第6-8天之间表达水平无统计学差异（P〉0.05）,其余各时段间表达水平均有显著差异（P〈0.01）。不同浓度胰岛素刺激脂肪细胞24h,细胞中LRP16蛋白表达量与胰岛素浓度呈负相关（P〈0.01）。结论 LRP16蛋白随着前脂肪细胞分化的开启,表达量从无到有逐渐增加至高峰,并一直维持在高表达水平;胰岛素（INS）负调控脂肪细胞LRP16蛋白的表达。     

免疫相关GTP结合蛋白2的亚细胞定位分析

目的 对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法: 使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构,核定位信号(nuclear localization signal,NLS),核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测.采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆.测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取,纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG,Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装.转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436.使用免疫荧光染色方法检测内,外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况.使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体,内质网,脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况.结果: 生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为 40~41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279~281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网.测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry.荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴.结论: 免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关.     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

免疫相关GTP结合蛋白2的亚细胞定位分析

目的 对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法: 使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构,核定位信号(nuclear localization signal,NLS),核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测.采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆.测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取,纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG,Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装.转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436.使用免疫荧光染色方法检测内,外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况.使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体,内质网,脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况.结果: 生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为 40~41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279~281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网.测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry.荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴.结论: 免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关.     

DTL的亚细胞定位研究

目的 研究无齿蛋白同源物(denticleless protein homolog, DTL)的亚细胞定位变化,推测其可能的生物学意义。方法 在多种细胞和组织中对DTL的亚细胞定位进行免疫荧光(immunofluorescence, IF)和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测,并通过分步提取细胞成分和蛋白质印迹(Western blotting, WB)进行实验验证。结果 DTL在所有细胞的有丝分裂期,其亚细胞定位到细胞核染色质周围;在细胞的分裂间期,DTL在不同细胞和组织中亚细胞定位也有差别,DTL在正常细胞、组织以及精子细胞和小鼠精母细胞中主要表达在细胞核中,在大多数癌细胞、癌组织以及精原细胞中表达在细胞质中。结论 DTL亚细胞定位随着细胞周期发生转变,在不同类型细胞和组织也会发生转变,DTL随着细胞的增殖、分化存在质核转位的趋势,提示DTL可能通过亚细胞定位改变在细胞增殖、分化中发挥作用。     

应用基因芯片技术研究LRP16基因对成熟脂肪细胞功能的影响

目的：探讨LRP16基因对成熟脂肪细胞功能影响及其潜在的临床意义。方法：应用高通量基因芯片分析技术,比较高表达LRP16的成熟脂肪细胞与正常表达组的差异。结果：实验组与对照组间差异表达基因共有1222个,其中653个上调,569个下调。结论：对脂肪细胞LRP16的总体功能是促进（微）炎症状态,对脂肪分化、胰岛素抵抗以及糖脂代谢都有影响。     

UGRP1蛋白的表达、纯化、抗体制备及亚细胞定位

目的 子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白.通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1.将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白.此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体.用Western 印迹的方法检测多抗血清.通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位.结果 成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体.免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆.结论 研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达.经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础.     

UGRP1蛋白的表达、纯化、抗体制备及亚细胞定位

目的子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白。通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础。方法从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1。将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白。此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用Western印迹的方法检测多抗血清。通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位。结果成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体。免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆。结论研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达。经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础。     

高表达LRP16基因对前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的研究LRP16基因高表达对前列腺癌细胞增殖及侵袭生长的影响。方法利用稳定转染LRP16基因的细胞系,以MTT法测定细胞增殖活性,以平铺Matrigel胶的Transwell培养小室检测细胞的侵袭生长能力。结果高表达LRP16基因对ALVA41细胞(雄激素受体阳性)的增殖没有影响,而对DU145细胞(雄激素受体阴性)则有促进增殖的作用;高表达LRP16基因可抑制ALVA41细胞的侵袭生长,而对DU145细胞的侵袭生长没有影响。结论高表达LRP16基因促进DU145细胞增殖,而抑制ALVA41细胞侵袭生长,可能与除雄激素受体以外的其他机制有关。     

抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性

目的 探明LRP16的表达与化疗药物足叶乙甙所诱导的肿瘤细胞凋亡是否产生作用以及可能的分子机制.方法 首先将抑制LRP16表达的小干扰RNA,control,siRNA,siRNA-374(抑制率90％),siRNA-668(抑制率60％),对照分别转染入Hela细胞内,并通过足叶乙甙处理的细胞而导致DNA损伤.之后用CCK-8检测细胞活力;用流式细胞技术测定抑制LRP16的表达对Hela细胞凋亡率的影响;通过RT-PCR检测抑制LRP16表达之后核转录因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)凋亡相关的下游靶基因的mRNA水平.结果 在足叶乙甙(100μmol)的作用下,抑制LRP16的表达能够明显抑制细胞的增长(P＜0.05),并呈浓度依赖性,同时增加细胞的凋亡率(P＜0.05).RT-PCR结果显示,下调LRP16的表达减弱NF-κB的转录活性,进而对其下游靶基因的水平进行调节.结论 LRP16在足叶乙甙导致的凋亡起重要作用,而且可能是通过下调NF-κ B的活性来发挥化疗药物抵抗效应.我们的实验结果初步证实抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性.     

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定

目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。     

LRP16基因的多克隆抗体制备及表达的探索

目的:制备人LRP16蛋白多克隆抗体并利用该抗体检测LRP16蛋白表达及亚细胞定位。方法:利用已构建的pRSET-C载体和LRP16基因组成的连接产物转化BL-21缺陷型大肠杆菌。诱导该基因原核表达,快速蛋白免疫法获取相应的多克隆抗体,利用免疫组化法观察LRP16基因产物在人多种组织中的表达差异。结果:成功获得高效的LRP16抗体,利用该抗体初步证实LRP16基因编码产物的在不同雌激素受体水平的组织分布特点。结论:制备的LRP16抗体及其全长基因可用于LRP16基因的生理功能及病理学研究,初步发现LRP16基因的表达与雌激素受体呈正相关。     

LRP16在肝硬化组织、癌旁组织及癌组织中的表达及意义

目的:探讨白血病相关蛋白16(LRP16)在肝癌中的表达规律,寻求其作为肝癌早期诊断及判断临床预后指标的可能性。方法:用Western印迹杂交法检测42例肝癌标本或新鲜组织中LRP16的表达情况,分析其与病理因素的关系。结果:LRP16在肝硬化组织、癌旁组织及癌组织中均有表达,但表达量依次减少。LRP16高表达者一般肿瘤直径较小,具有完整的包膜,一般无血管侵犯,多为中低分化腺癌。结论:LRP16高表达者具有较好的生物学特性。LRP16可能在判断肝癌生物学特性方面具有一定前景。     

应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白。方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础。     

新的白血病相关基因LRP16的克隆

目的 发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制。方法 应用分子克隆技术ＲＬＧＳ及ＲＡＣＥ技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因。结果 克隆到一个长度为２９４８ｂｐ的ＤＮＡ片段,经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分,并定位于第１１号染色体长臂１１区,进一步克隆到这一基因的全长ｃＤＮＡ,其长度为９８０ｂｐ,并被国际基因库以新的人类基因ＬＲＰ１６收录入库。结论 ＲＬＧＳ及ＲＡ