丹参毛状根培养的建立和丹参酮的产生

丹参毛状根培养的建立和丹参酮的产生张荫麟,宋经元,吕桂兰,刘惠灵(中国医学科学院药用植物研究所北京100094)丹参SalviamiltiorrhizaBunge是治疗心血管系统疾病的重要中革药,主要成分如丹参酮具有活血、抗菌等活性,同时也是一种红色色素。利用细胞培养方法来生产这些活性成分,不仅对满足临床用药需要有重要意义,作为一种具有生理活性的色素开发也有良好前景。植物毛状根培养是80年代发展起来的植物基因工程和细胞工程相结合的?...     

改进CTAB法提取红豆杉毛状根DNA

目的:寻求提取高质量红豆杉毛状根基因组DNA的方法。方法:采用改进CTAB法提取发根农杆菌R1000诱导的红豆杉毛状根的基因组DNA,进行紫外分光检测、电泳分析及特异PCR扩增。结果:提取的DNA质量较好,纯度较高,可以满足进一步实验的要求。结论:运用改进CTAB法提取红豆杉毛状根基因组DNA,比传统方法更好地减少了基因组DNA中多糖、酚及次生代谢物的污染,不失为一种较好的提取方法。     

丹参毛状根化学成分稳定性研究

目的:研究丹参毛状根的化学物质稳定性,为进一步探索丹参毛状根作为原料药的可行性提供研究基础。方法:PCR扩增10批丹参毛状根的rolA基因,HPLC指纹图谱分析10批丹参毛状根的化学成分稳定性。结果:PCR结果表明,外源基因rolA在10批样品的基因组DNA中均可以检测到;通过对丹参毛状根的指纹图谱研究,10批毛状根的相似度均在0.970以上。结论:不同批次丹参毛状根样品间化学成分的差异不显著。     

甘草毛状根的研究

本文详细报道了乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)等五种廿草毛状根诱导和培养的研究情况,并通过Opine的检出和GUS活性的测定检查了PRi 15834和pGSGlucl的导入情况。不同培养基试验表明,W.P培养基最有利于毛状根S.a-s-4株的生长。高压液相测定和甜味试验证明,甘草毛状根中不含有甘草酸。     

流式细胞仪检测铁皮石斛核DNA初探

目的利用流式细胞仪建立一套快速检测铁皮石斛核DNA的方法,为铁皮石斛倍性育种提供技术支持。方法以二倍体铁皮石斛为试材,通过优化实验材料用量、提取液用量、离心时间、染色剂用量、染色时间对离体培养的铁皮石斛新鲜幼嫩叶片进行核DNA检测。结果表明铁皮石斛最佳流式细胞术条件为叶片150 mg、Otto提取缓冲液2 ml、2 000 r/min离心8 min、PI含量50μg/ml、孵化50min。碎片峰较少,变异系数(CV)低。结论筛选出了较为快速、准确的利用流式细胞仪检测铁皮石斛倍性的方法。     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

丹参植株原位侵染RNAi毛状根体系的建立及其干扰效果

目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究。方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况。结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%。实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根。结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究。     

决明毛状根化学成分研究

目的：研究决明毛状根的化学成分。方法：用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes 9402菌株从决明子叶外植体上诱导产生毛状根,在MS0液体培养基中大量培养获得。并采用色谱技术和波谱手段对毛状根的化学成分进行分离鉴定。结果：从决明毛状根95%乙醇提取物的醋酸乙酯部分分离鉴定了8个化合物,分别是白桦酯酸、大黄酚、大黄素甲醚、豆甾醇、1-羟基-7-甲氧基-3-甲基蒽醌、大黄酚-8-甲醚、大黄酚-1-甲醚和芦荟大黄素。其中芦荟大黄素是首次从决明毛状根中分得。结论：决明毛状根能合成与原植物相似的化学成分。     

王不留行毛状根培养体系建立及其黄酮苷的测定

目的建立王不留行毛状根培养体系。方法分别用发根农杆菌R15834、R1601、R1000、A4感染王不留行叶片产生毛状根,考察不同理化因子对其生长的影响,并利用HPLC测定王不留行中黄酮苷的量。结果发根农杆菌R1601转化王不留行叶片的诱导率最高,p H值为6.0,蔗糖浓度为3%的MS培养基培养毛状根增殖速度最快,王不留行毛状根中王不留行黄酮苷量略高于种子中的量。结论王不留行成功诱导毛状根,为进一步筛选适宜的王不留行发根培养体系并调控次生代谢产物的研究奠定了基础。     

大规模培养的黄芪毛状根急性毒性研究

对黄芪毛状根、野生黄芪和栽培黄芪的急性毒性进行了初步研究,结果表明三者均符合药典规定的毒性要求,可安全药用。     

甘草毛状根的组织形态研究

本文详细描述了乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)毛状根的外部形态和内部构造,并与其实生苗的幼根进行比较。毛状根粗细均匀,与实生苗幼根呈长圆锥形不同。内部构造纵切面观可分为根冠、生长点、延长区和成熟区四部分;横切面观不论在成熟区还是以上部分,均维持初生构造,维管束辐射型,初生木质部四原型,中央无髓,而与其实生苗的幼根在初生构造后不久迅速转入次生生长、形成次生构造不同。     

黄芪毛状根的研究

本文报道了黄芪Astragalus membranaceus毛状根诱导和培养的研究情况,并通过Opine的检出和GUS活性的测定检查了PRi15834和pGSGIucI的导入情况。HPLC测定证明,黄芪毛状根中含有黄芪皂甙甲。     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。     

金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立

目的:研究金铁锁毛状根制备方法及液体培养条件,为规模化生产金铁锁提供技术支持.方法:利用发根农杆菌ACCC10060菌株侵染金铁锁幼叶及茎段.结果:将外植体与菌液(A6000.8)在含有20mg·L-1乙酰丁香酮的B5培养基上共培养48h,可以有效地诱导金铁锁毛状根;叶片比茎段的诱导率高.转化的毛状根具有激素自养和抗卡那霉素的特性,并且组织中含有冠瘿碱,证明该菌对金铁锁组织成功地进行了转化.在无激素的1/2Ms液体培养基中培养35d后,金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍(鲜重)和8.39倍(干重),其总皂苷为0.857%(干重),愈伤组织和原植物中分别为0.388%,0.217%.结论:金铁锁毛状根离体培养系统的成功建立,对进一步规模化培养金铁锁毛状根具有重要意义.     

丹参功能基因组学研究Ⅱ——丹参毛状根不同时期基因表达谱分析

目的：研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱,发掘丹参功能基因。方法：通过比较不同时期丹参毛状根的生长量和次生代谢产物含量确定用于cDNA芯片杂交的材料。采用间接标记法进行探针标记后进行杂交反应,GenePix Pro 4.0软件对芯片图像进行分析,数据用Lowess方法进行归一化处理。采用两倍差异标准结合T检验来确定差异表达基因。Northern点杂交检验4个基因与芯片杂交结果的一致性。差异基因单向测序后经过gap4软件拼接聚类,然后利用BLASTX,BLASTN进行比对分析,利用Gene Ontology和KEGG进一步预测基因的功能。结果：30~45 d为丹参毛状根的快速增殖期,45~60 d为丹参次生代谢产物的快速积累期。将45,60 d丹参毛状根分别与30 d材料进行杂交,得到203个差异基因。4个基因Northern点杂交的结果与芯片杂交结果一致。测序后得到172条EST,拼接聚类后形成114个Unigene,其中功能已知基因62个,功能未定的假想蛋白34个,相似性较低的未鉴定基因9个,无显著相似性的基因9个。 “GO”分类中67个基因得到注释,KEGG分析中74个基因得到注释,26个有详细的代谢途径分析。结论：得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段,为深入开展丹参功能基因组学研究提供了基础。     

转基因何首乌毛状根化学成分的研究

目的研究转基因何首乌毛状根中的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱等方法分离何首乌毛状根中的化学成分，并根据理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果从何首乌毛状根60％乙醇提取物中分离得到了12个化合物。利用理化性质及波谱技术确定其结构分别为：2，3，5，4’-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（1）、没食子酸（2）、没食子酸甲酯（3）、3，5-二羟基苯甲酸（4）、丁香酸（5）、对羟基苯甲酸（6）、胡萝卜苷（7）、β-谷甾醇（8）、豆甾醇（9）、烟酸（10）、碳直链十七酸（11）、碳直链三十一酸（12）。结论上述12个化合物均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到；化合物3，4，5，6为首次从该种植物中分离得到。     

植物激素对丹参毛状根生长和丹参酮生物合成的影响

目的:研究植物激素对固体培养丹参毛状根生长和丹参酮ⅡA生物合成的影响。方法:组织培养法诱导毛状根、超声法提取丹参酮、高效液相色谱法测定丹参酮。结果:在1/2 MS培养基中添加一定浓度GA3与6-BA的组合激素对丹参毛状根生长有抑制作用,最高抑制作用达到100%(毛状根死亡),而添加1.0 mg/L KT与1.0mg/L IBA的组合激素则可以明显促进丹参毛状根的生长,生长量是对照的3.251倍;添加0.2 mg/L NAA和3.0mg/L 6-BA与3.0 mg/L NAA的组合激素时丹参毛状根体内丹参酮ⅡA的总含量最高;添加2.0 mg/L 6-BA则对丹参酮ⅡA的生物合成有显著促进作用,丹参酮ⅡA浓度是对照的3.012倍。结论:在丹参毛状根培养基中加入不同的植物激素及其组合激素对毛状根的生长和丹参酮ⅡA的生物合成有显著的影响。     

决明毛状根化学成分的研究

目的 研究决明毛状根的化学成分。方法 应用毛状根培养技术,在实验室摇瓶积累生产决明毛状根干重90g,结果 从中分离得到1个化合物,根据其理化性质和波谱分析。鉴定为betulinic acid（桦木酸）。结论 此化合物为决明毛状根和该属植物中首次分离得到。通过决明毛状根与其干燥种子、根、茎、叶的化学成分在薄层层析上比较。结果表明,决明毛状根培养可代谢产生桦木酸或大幅度提高桦木酸的含量。     

丹参CYP76AH1转基因毛状根的建立及其蛋白的分离

蛋白质复合物参与植物多种次生代谢物的合成,其分离对阐明植物次生代谢及提高体外催化效率至关重要。该研究构建了过表达丹参酮合成途径关键酶CYP76AH1的转基因毛状根株系,通过Western杂交筛选得到高表达CYP76AH1蛋白的丹参转基因毛状根,并以此作为后续提取丹参酮合成途径中蛋白质复合物的组培材料。通过优化蛋白提取缓冲液中的去污剂种类和浓度,筛选出含0.5%Triton X-100的缓冲液为最佳提取缓冲液,并分离得到相对大量的可溶性CYP76AH1蛋白质。该研究为后续进一步分离纯化与CYP76AH1相互作用的蛋白质复合物奠定了基础,也为深度解析丹参酮合成代谢通路提供思路。     

何首乌毛状根培养及大黄酚的含量测定

目的 测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法 用发根农杆菌Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体,均可诱导出毛状根,并能合成大黄酚,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。结果 毛状根中大黄酚的含量为0．0164％。结论 该毛状根具有典型的毛状根形态特征,大黄酚含量低于何首乌药材。