改良体外培养方法及诱导剂配比条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞取材方便,易于体外扩增,其体外培养方法及诱导分化仍需要改良.目的:对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法及诱导剂配比进行改良,观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能.设计:观察实验.单位:解放军广州军区广州总医院医学实验科.材料:实验于2004-07/2006-06在解放军广州军区总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成,选用20只成年SD大鼠,清洁级,雌雄不拘,体质量140～180 g,由解放军广州军区广州总医院动物实验中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.β-甘油磷酸纳,地塞米松,维生素C均为美国Sigma公司产品,羊抗大鼠骨钙素抗体购自美国DSL公司,S-P免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发有限公司产品.方法:采用改良法进行细胞的培养及诱导细胞成骨.①骨髓间充质干细胞分离及培养:大鼠麻醉后处死分离双侧股骨、胫骨骨髓制备单细胞悬液接种于培养瓶中,培养后48及96 h半量更换培养液,以去除未贴壁的造血细胞,以后每3 d换液1次,进一步去除未贴壁的细胞,待细胞汇合约80%时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1:2传代培养.将第2代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板和玻璃平皿中,48 h后吸去基础培养液.②骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化:应用含终浓度分别为10 mmol/L、10-7 mol/L、50 mg/L的地塞米松、β-甘油磷酸纳和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化.主要观察指标:①应用改良的培养方法及自行配比的培养液诱导分化后10 d采用钙钴法测定碱性磷酸酶活性.②培养后12 d采用免疫组织化学法检测骨钙素分泌情况.③诱导培养后2周采用Von kossa染色检测细胞矿化作用.结果:①碱性磷酸酶活性:经诱导后细胞碱性磷酸酶染色明显,胞质中刚性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色.②骨钙素分泌情况:细胞经诱导后骨钙素阳性较明显,胞核呈蓝色,胞浆呈棕色.③细胞矿化作用:细胞经诱导培养后呈复层生长,并出现不透明结节,Von kossa染色可见黑色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化基质沉积.结论:改良法可成功培养及诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨.     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景:目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少.目的:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点.方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化.结果与结论:培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性.扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃.     

诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景:诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟,但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段.目的:观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,雌雄不限,体质量150～200 g.方法:采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养,诱导组分别于接种当时、细胞达50%～60%融合时、细胞达85%～95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导.非诱导组采用普通培养基培养.主要观察指标:诱导后7,14 ,21,28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力.定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况.结果:经钙钴染色后,诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应,胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒,大多数多角形细胞呈阳性,如铺路卵石样排列,随着时间的延长,可见片状强阳性细胞,以细胞达85%～95%融合时诱导培养组数量最多,结节体积最大.非诱导组未见片状强阳性细胞.Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节.以细胞达85%～95%融合时诱导培养组形成结节较早,同期相比数量较其他组多.细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高,表现细胞成骨分化特点.结论:初始接种密度相同的情况下,细胞间相互接触程度越高,成骨能力越强.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨诱导的动态观察

背景:骨髓间充质干细胞由于其具有多向分化潜能和高增殖潜能而在组织工程领域具有广泛的应用前景.目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞在向成骨细胞分化过程中细胞及生物活性变化.设计、时间和地点:随机对照实验,实验于2004-07/2006-06在解放军广州军区广州总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成.材料:成年清洁级SD大鼠20只,雌雄不拘用于取骨髓.方法:按随机数字表法将动物分为实验组和对照组,每组10只.通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,对照组以基础培养液(10%胎牛血清 高糖DMEM 100U/L青霉素 100 U/L链霉素 2 mmol/L谷氨酰胺)培养,实验组用条件培养液(基础培养液,10 mmol/Lβ-甘油磷酸纳,10-7 mol/L地塞米松,50 mg/L维生素C)进行诱导培养.一段时间后制备细胞爬片.主要观察指标:①用倒置显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态学观察.②采用Gomori改良钙钴法进行碱性磷酸酶染色,应用免疫细胞化学染色方法测定骨钙素的表达.结果:骨髓间充质干细胞接种48 h后,较多细胞贴壁,72 h后增殖,生长良好;7～9 d时细胞融合率可达到80%.透射电镜下骨髓间充质干细胞的细胞核较大,形态幼稚.经过体外成骨诱导的骨髓间充质干细胞表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征,诱导1周后表达碱性磷酸酶活性,2周后骨钙素表达呈阳性.结论:骨髓间充质干细胞经体外成骨定向诱导1周后进入成骨细胞的转化过程,并可以保持一定程度的增殖活性,可作为骨组织工程的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的：观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法：实验于2004-10／2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只，经兔髂嵴无菌抽取骨髓，采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化，将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞，分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组（向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养，对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察），对照组（采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基），两组进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定，并进行细胞成脂和成骨率比较。结果：从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞，其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染，8只获得成功进入结果分析。①在经过2ld成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴，苏丹脂肪染色呈橘红色，同时Kossa法也检测出少许成骨分化，其比例为70％（28／40）干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞；10％（4／40）干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积，Von Kossa法测定形成的钙结节，同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化，其比例为40％（16／40）干细胞可转化为成骨细胞，20％（8／40）骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5％（2／40）骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，用Von Kossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10％（4／40）。结论：在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞，另一部分转化为成骨细胞，两者分化存在一定关系：分化的脂肪细胞多，则成骨细胞少；分化的成骨细胞多，则脂肪细胞少。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的:观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。方法:实验于2005-03/11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作:骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液(DMEM-LG培养基、体积分数为0.1的胎牛血清)常规培养;骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂;内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞;诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1∶1的比例接种于培养板中,加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。结果:①免疫细胞荧光染色结果:内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色结果:均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果:各组细胞增殖差异无显著性(P>0.05)。④碱性磷酸酶活性:除内皮细胞诱导组外,其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高,联合培养组增长最明显,第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到(618.46±28.34)nkat/L,高于其他各组(P<0.05)。⑤骨钙素检测结果:在培养的第7天、第14天,联合培养组的骨钙素分泌量分别为2.03,3.17μg/L,明显高于其他各组(P<0.01)。结论:由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性,提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的:观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法:实验于2004-10/2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只,经兔髂嵴无菌抽取骨髓,采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化,将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞,分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组(向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养,对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察)照组(采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基),两组,对进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定,并进行细胞成脂和成骨率比较。结果:从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞,其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染,8只获得成功进入结果分析。①在经过21d成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴,苏丹脂肪染色呈橘红色,同时Kossa法也检测出少许成骨分化,其比例为70%(28/40)干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞;10%(4/40)干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积,VonKossa法测定形成的钙结节,同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化,其比例为40%(16/40)细胞可转化为成骨细胞,20%干(8/40)骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5%(2/40)骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞,用VonKossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10%(4/40)。结论:在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞,另一部分转化为成骨细胞,两者分化存在一定关系:分化的脂肪细胞多,则成骨细胞少;分化的成骨细胞多,则脂肪细胞少。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中26RFa的作用

背景：研究表明26RFa在骨形成、痛觉、内分泌、心血管以及能量代谢等方面都有重要的调节作用。目的：观察26RFa在成骨培养体系中对人骨髓间充质干细胞增殖分化的影响。 方法：通过MTT实验,以此确定26RFa对人骨髓间充质干细胞是否有促增殖作用及其起作用的最大活性浓度;将人骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板上,实验分为2组：实验组含有10-11mol/L的26RFa,对照组不含26RFa。取成骨诱导8,12,16 d细胞用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性;成骨诱导21,28 d后行茜素红染色和Von Kossa染色,计算每张玻片钙化结节数,Western blot检测cbfa1的表达。 结果与结论：成骨诱导8,12,16 d后细胞内碱性磷酸酶活性实验组高于对照组（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.05）;21,28 d后茜素红染色和Von Kossa矿化结节数实验组均高于对照组;实验组细胞cbfa1表达明显高于对照组（P〈0.05）。说明在适宜的培养条件下,26RFa可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

骨髓基质细胞复合人脱细胞骨的成骨活性

背景:寻找一种既保持支持功能良好又具有一定成骨活性的同种异体骨是治疗骨缺损的重要研究课题。以往曾对比测定脱细胞骨的生物力学性质,发现其与正常大小的新鲜骨质在最大抗压力,压强方面无显著性差异。人脱细胞骨复合骨髓基质细胞后的成骨活性如何,是否能够保持成骨的活性是临床医生非常关心的问题。目的:研究人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测。设计:单一样本实验。单位:哈尔滨医科大学附属第二医院。材料:实验于2003-01/2004-08在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成。脱细胞骨(取新鲜尸体髂骨块,自愿捐献)。方法:用过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养。通过碱性磷酸酶和骨钙素检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。主要观察指标:①人骨髓基质细胞/脱细胞骨复合物碱性磷酸酶和骨钙素检测结果。②人骨髓基质细胞/脱细胞骨复合物组织学观察结果。结果:①人髂骨块细胞清除干净,骨基质保存良好。②诱导8d后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量明显高于对照组[诱导后骨髓基质细胞:(181.54±40.01)nkat/L,(7.2±1.3)μg/L,对照组:无法测到,P<0.05]。③骨髓基质细胞在人脱细胞骨支架内附着紧密,生长良好。结论:人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法：实验于2006-08/2007—06在吉林大学药学院生物工程实验室完成，实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只，由吉林大学基础医学院动物培养中心提供，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限，实验动物级别为二级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利甩成骨诱导剂包括0．1μmol／L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol／L β-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10％FBS的L．DMEM、0．25μmol／L地塞米松、50μmol／L吲哚美辛、0．5mmol／LIBMX、10mg／L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果：①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44，而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14d后细胞不明显，未形成钙结节，21d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分?     

红细胞裂解法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少,而且与其他细胞特别是易与红细胞相混杂,因此在分离过程中需去除干扰,以获得尽可能多的高纯度的骨髓间充质干细胞。目的:采用红细胞裂解法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,同时进行生物学鉴定。设计:观察对比实验。单位:中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室。材料:选用50只生后30d的雄性SD大鼠,体质量100g,SPF级,购自北京实验动物中心(合格证:SCXK(京)2002-0003)。DAB浓缩显色液(含过氧化氢,中杉公司),兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),FCS(PAA,Austria),LG-DMEM培养基(Sigma,USA)。方法:实验于2004-09/2005-09在中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室完成。将大鼠脱臼处死,暴露骨髓腔,收集细胞悬液,采用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞分离与原代培养。①红细胞裂解实验:取A、B、C、D4管分别加入0.5mL过滤并充分吹打均匀后的骨髓冲洗液,分别对应加入红细胞裂解液、氯化氨2mL、磷酸盐缓冲生理盐水2mL和体积分数为0.04的乙酸溶液0.5mL,分别测量各组吸光度值及血红蛋白浓度,并观察细胞生长情况。②骨髓间充质干细胞生长曲线、倍增时间及表面标志分子表达情况的观察:根据公式:群体倍增时间(TD)=t[lg2/(lgNt-lgN0)](N0和Nt分别代表接种后和培养t小时的细胞数),计算出细胞的群体倍增时间并描绘并分析骨髓间充质干细胞第2、4、6代细胞的生长曲线;采用亚甲基兰染色测定骨髓间充质干细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的观察结果。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响。③第2、4、6代细胞的生长曲线及细胞倍增时间。④大鼠骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。结果:①大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养结果:原代培养48h后大部分细胞已贴壁,72h时贴壁细胞已开始分裂增殖。7￣8d后可见有明显集落形成,之后集落迅速增多,不断扩大,互相融合,14～16d时细胞克隆生长稠密。刚传代的细胞呈球形,很快沉降贴壁,少部分圆形细胞悬浮。贴壁细胞均匀分布,3～5d增殖迅速。虽然传代后细胞形态未变,但增殖速度明显增快,约6d长满培养瓶底。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响:红细胞裂解液处理组,氯化氨处理组和4%乙酸处理组的血红蛋白浓度明显高于磷酸盐缓冲生理盐水处理组,差异有显著性(P<0.01)。③不同代骨髓间充质干细胞的生长曲线观察结果:第2,4,6代细胞生长曲线基本相同,经过一两天的潜伏适应期后进入对数生长期,第5天达顶点,以后进入平台期(在第5～7天)。第6代骨髓间充质干细胞的潜伏期表现不明显骨髓间充质干细胞的群体倍增时间平均约为34h。④不同代骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定:各代细胞CD44和CD106染色均呈阳性,表现为棕黄色颗粒沉淀,CD34染色呈阴性。结论:采用红细胞裂解液处理骨髓冲洗液后再行接种,能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,同时不影响其贴壁后的生长,是一种可行的分离方法。细胞表面标记染色鉴定证明,本实验所分离细胞是骨髓间充质干细胞。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的:采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论:采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h;细胞周期分析表明:G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

非诱导条件下犬骨髓基质干细胞的生物特性

背景种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最重要的基础环节,骨髓基质干细胞以其诸多优点,成为理想的骨组织工程的种子细胞.目的观察骨髓基质干细胞在体外培养的生长特点和非诱导条件下的成骨特性.设计单一样本实验.单位福建医科大学附属口腔医院种植中心.材料实验于2003-05/12在福建医科大学附属口腔医院中心实验室完成.骨髓基质干细胞来自4只1岁龄的杂交犬的原代～第3代传代细胞.方法无菌条件下在杂交犬两侧股骨大转子部做骨髓穿刺,抽取5 mL肝素抗凝的骨髓,加入到含有50 mL含双抗Dulbecco's改良的Eagle's培养液的离心管中分离单个核细胞,进行首次提纯获取骨髓基质干细胞单细胞,置培养箱中培养传代,培养48 h后,吸除培养液,以后每3天换液1次.继续传代.采用倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察骨髓基质干细胞形态;每天进行细胞计数,测定倍增时间,绘生长曲线;用钙钴法检测碱性磷酸酶;用茜素红法染色观察钙化结节生长情况.主要观察指标①犬骨髓基质干细胞光镜结构.②犬骨髓基质干细胞生长曲线.③成骨分化指标碱性磷酸酶及钙化结节的观察.结果①形态学观察表明,骨髓基质干细胞贴壁细胞呈集落生长,有成纤维样细胞外观,未加入成骨诱导剂,细胞形态发生变化.②碱性磷酸酶表达原代细胞呈强阳性,第1代细胞呈阳性,第2,3代细胞呈弱阳性.③钙沉积出现,原代细胞染色强于传代细胞.结论①骨髓基质干细胞在体外培养能大量扩增,具有自然向成骨细胞分化的能力,是骨组织工程理想的种子细胞.②3代内扩增的骨髓基质干细胞有成骨活性,但原代细胞传代活性优于传代后细胞.     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为（24.04±0.49）h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S＋G2＋M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

低强度脉冲式超声对兔脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞复合体的影响

背景:有关低强度脉冲式超声波促进关节软骨损伤修复的研究较多,可供选择的细胞支架亦较多,但是有关低强度脉冲式超声波的应用条件及构建出理想的组织工程软骨细胞支架尚未达到共识.目的:构建新西兰兔同种异体脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的复合体.给予一定条件的低强度脉冲式超声波刺激,以探讨脱细胞脱钙骨基质作为组织工程软骨支架的可行性和低强度脉冲式超声波刺激对关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的促进作用.设计、时间及地点:多个样本观察,实验于2009-05/08在解放军第二军医大学生物医学工程研究所完成.材料:应用新型改良Urist法制备兔脱细胞脱钙骨基质.采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞;采用全骨髓漂洗法分离出骨髓间充质干细胞并加以纯化,进行体外单层培养扩增.方法:按与脱细胞脱钙骨基质复合的细胞成分不同及是否应用低强度脉冲式超声波刺激不同分为4组:软骨细胞组、骨髓间充质干细胞组、复合细胞组:脱细胞脱钙骨基质分别与软骨细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,未进行低强度脉冲式超声波刺激.超声组:将脱细胞脱钙骨基质与软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,第2天进行低强度脉冲式超声波刺激,刺激频率1.0 MHz、瞬时空间强度10 mW/cm~2,20 min/d.主要观察指标:①平面培养第2代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞行免疫组织化学检测.②新型改良Urlet法制备的脱细胞脱钙骨基质行苏木精一伊红染色.③于细胞-支架复合第21天行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测.结果:①平面培养第2代关节软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,可见细胞形态为多角形、星形、圆形,有伪足伸出,胞质内容丰富,胞浆明显呈棕黄色,胞核为圆形.②平面培养第2代骨髓间充质干细胞的CD34免疫组织化学染色呈阴性,CD44及CD105免疫组织化学染色呈阳性.③新型改良Urist法制备的兔脱细胞脱钙骨基质内未见明显的细胞样结构,空隙大小均匀.④复合第21天后,骨髓间充质干细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,软骨细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色弱阳性,复合细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,超声组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性.结论:①第1-3代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞与原代细胞的生物学性能相似.②在脱细胞脱钙骨基质内,软骨细胞和骨髓间充质干细胞可以保持较高的增殖能力.③10 mW/cm~2的低强度脉冲式超声波不影响骨髓间充质干细胞活性,并且能够加速其向关节软骨细胞分化,但未发现有明显促进细胞增殖的作用.     

GDNF 基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞促周围神经再生的实验研究

目的：探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）促周围神经再生。方法建立大鼠坐骨神经损伤模型,实验分为2组：对照组为未经诱导 BMSCs 组,实验组为 GDNF 基因诱导后 BMSCs组。每组20只 SD 大鼠。①术后4周和8周观察坐骨神经指数和腓肠肌湿质量恢复率。②术后8周测量再生神经纤维轴突直径、髓鞘厚度及有髓神经纤维计数。③术后4周腓肠肌肌细胞行 DAPI 染色。④术后8周坐骨神经扫面电镜观察神经丝再生交联情况。结果经 GDNF 基因诱导 BMSCs 组各方面检测指标均较对照组为好,其中诱导后实验组扫描电镜下观察周围神经再生更加明显。结论GDNF 基因诱导的间充质干细胞对周围神经再生有着显著的疗效。     

富血小板血浆及带血管筋膜在组织工程骨血管化中的作用组织影像学观察

背景：富血小板血浆中的多种生长因子及带血管筋膜是否具有促进骨再生及血管化作用尚在争论之中。目的：拟从组织影像学角度评价富血小扳血浆及带血管筋膜对骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合的组织工程骨血管化作用效果。设计、时间及地点：单一样本观察及动物同体对照实验，于200410／200711在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：1-12月龄健康杂种犬12只，体质量20～25妇，雌雄各半。方法：④采用密度梯度离心法从犬骨髓中分离骨髓基质干细胞，体外贴壁培养扩增、成骨诱导培养。取杂种犬的股骨制备脱钙骨基质，并与骨髓基质干细胞复合。②将每只犬的背部分为4个区，A，B区，植入加富血小板血浆的骨髓基质干细胞，脱钙骨基质复合体，C，D区，仅植入骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合体。A，C区植入物用背阔肌带血管肌筋膜包囊；B，D区植入物用背部不带血管的浅筋膜包裹。分别在4，8，12周各取4只，雌雄各半，麻醉后处死取标本。主要观察指标：④采用倒置相差显微镜观察骨髓基质干细胞形态，四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线。②行改良钙钴法碱性磷酸酶染色，VonKossa法、茜素红法，钙结节染色观察诱导成骨细胞形态特征。③应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察复合体的结构。④行大体标本、X射线数字影像及组织学观察评价。结果：①诱导成骨分化的骨髓基质干细胞分泌的碱性磷酸酶及钙结节染色均呈阳性。②骨髓基质干细胞和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。⑨同种异体脱钙骨基质与骨髓基质干细胞复合培养后，细胞上架率高，生长状态好，增殖迅速，能分泌大量细胞外基质。④各时间点A，B，C区在成骨的骨量、骨光学密度、血管化程度等方面均明显优于D组（P〈0．05）。结论：经组织影像学观察证实，富血小板血浆和带血管肌筋膜均能促进组织工程骨的成骨和血管化，且两者具有协同作用。     

壳聚糖凝胶活性载体与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶（Chitosan—disodiumB—glycerolphosphate，C／GP）与软骨细胞显示了良好的相容性，因此假设作为组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞也与C／GP凝胶有较好的细胞相容性。目的：观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶中生长、增殖和成软骨分化，探讨C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞的细胞相容性，为软骨组织工程材料寻找新的适宜细胞载体。设计、时间及地点：完全随机对照，细胞组织工程实验，于2005—10／2006—05在解放军第三军医大学西南医院中心实验室完成。材料：成年雌性小型猪6只用于收集骨髓，培养骨髓间充质干细胞。方法：取培养后传至第3代的骨髓间充质干细胞用于实验。在成骨培养条件下检测骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙沉积，在成软骨培养条件F行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。壳聚糖盐酸溶液与β-甘油磷酸钠溶液混匀后，置37℃孵箱内5～10min即形成壳聚糖β甘油磷酸钠凝胶。成软骨培养3周，倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内黏附及成活情况，组织免疫组织化学法分析骨髓间充质干细胞在凝胶内成软骨分化情况，MTT法检测骨髓间充质干细胞种植2，5和8d后增殖情况。主要观察指标：①猪骨髓间充质干细胞的特征。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活。⑧骨髓间充质干细胞在C／GP内的成软骨分化。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖。结果：①猪骨髓间充质干细胞的特征：体外培养的骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样形态，在成骨和成软骨诱导条件下可分别向成骨样细胞和软骨细胞分化。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活：MTT染色发现，骨髓间充质干细胞植入C／GP凝胶21d内，细胞黏附于凝胶内并保持90％以上成活。③骨髓间充质十细胞在C／GP内的成软骨分化：体外培养21d后成软骨诱导的骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内产生大量软骨基质。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖：成软骨诱导骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内持续增殖，细胞种植后2，5和8d，细胞增殖程度差异明显（P〈0．05）。结论：C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞显示了良好的细胞相容性，有利于骨髓间充质干细胞在其内生长、增殖和成软骨分化，有孳作为软骨组织工种的细胞载体。