胚胎干细胞来源神经前体细胞在缺氧缺血性脑损伤海马内的分化

目的研究胚胎干细胞(ESC)来源的神经前体细胞移植入缺氧缺血性脑损伤(HIBD)脑内后,在海马的迁移和分化.方法小鼠ESC体外培养和诱导分化,制作小鼠HIBD模型.术后第2～3天,将细胞植入损伤侧侧脑室.对脑组织进行病理学、聚合酶链反应(PCR)、X-gal和免疫荧光组化染色等检测.结果小鼠ESC在特定条件下,能成功诱导分化为神经前体细胞.细胞移植后,经PCR检测和X-gal染色发现能长期存在于脑内,并迁移、分布于受损海马,构成海马结构,经进一步免疫荧光检测发现可分化为神经元;同时病理学检测亦发现细胞移植后受损海马内的神经细胞数量明显增加.结论体外经过特定的诱导分化后,ESC被定向诱导分化为神经前体细胞,植入HIBD小鼠脑内后,能迁移至损伤海马,分化为神经元,替代损伤或坏死的神经细胞,是其发挥治疗作用的可能机制之一.     

神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后分化神经元的形态学观察

目的 观察小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后新生神经元的分化情况.方法 将表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞采用无血清方法定向诱导为神经前体细胞,移植至Aβ1-40损伤的大鼠海马齿回,免疫荧光染色观察分化神经元的递质表型、受体表达以及与受者神经元的突触性接触.结果 小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植后能长时间存活并分化为谷氨酸能、γ-氨基丁酸能神经元,表达NMDA受体和GABAA受体;发出类似神经元的长突起伸入到受者脑组织中去,并且在其胞膜和突起周围可观察到大量受者神经元来源的突触素阳性颗粒.结论 神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后能分化为不同类型的神经元,与受者神经元之间可能存在突触结构.     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。     

神经干细胞移植促进缺氧缺血性脑损伤脑功能修复研究进展

缺氧缺血性脑损伤 (hypoxicischemicbraindamage ,HIBD)是新生儿常见疾病 ,目前对其治疗均立足于抑制其脑细胞死亡 ,并应用多种脑细胞活性药物促进其功能恢复 ,但对已死亡的细胞则显得力所难及。干细胞移植是目前研究的热点。干细胞能根据周围微环境诱导而增殖、分化成形态、功能与附近的宿主细胞非常类似的细胞类型 ,因而能部分补偿损伤和死亡脑细胞的功能[1] ,近年来随着对神经干细胞 (neuralstemcell,NSC)研究不断深入 ,发现NSC移植后不仅能增殖、分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞 ,且易于基因操作 ,可作为载体转染神经营养…     

基因工程神经干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤研究进展

缺氧缺血性脑损伤( hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因.目前临床上常用的治疗新生儿HIBD的方法如高压氧疗法、亚低温疗法等都仅局限于对症、支持治疗,只能在一定程度上缓解症状,尚难从根本上恢复神经系统功能.大量研究[1-3]发现,通过移植具有多向分化潜能的神经干细胞( neural stem cells,NSCs)能减少HIBD新生大鼠由于局部缺血而导致的神经细胞死亡,使之运动和学习记忆能力均得到提高.将经过基因修饰的NSCs进行移植,有望为HIBD的治疗提供一个崭新的思路.     

神经干细胞移植在缺血性脑损伤治疗中的应用

20世纪90年代以来,神经干细胞（neural stem cell,NSC）相继从胚胎和其他成体哺乳动物的中枢神经系统分离培养成功,“中枢神经系统受损后不能再生”的传统观点被打破,这为中枢神经系统疾病的治疗提供了新途径。NSC的研究成为神经科学领域研究的热点。NSC能分化为神经元和神经胶质细胞,参与脑组织结构和功能的修复,还可作为基因修饰载体用于中枢神经系统疾病的基因治疗。     

纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用

目的 观察采用ITSF和N2无血清培养基诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法 小鼠胚胎干细胞的培养和无血清诱导为神经有体细胞，NBT／BCIP染色，Nestin免疫组化染色。结果 细菌培养皿法或悬滴法培养胚体，ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养皿法表面，对胚体的贴壁情况影响不大，但能使无血清培养后存活的细胞增多。结论 小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞，在N2培养基中加入纤维连接有使存活的神经前体细胞数量增多。     

人胚胎皮层神经前体细胞的分离培养及鉴定

目的 从20周人胚皮层中分离神经前体细胞并鉴定其增殖及分化能力。方法 应用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清限制培养基从20周自然流产人胚胎皮层组织中分离神经前体细胞,通过神经球形成法使其不断增殖,利用BrdU检测细胞的增殖能力,去除生长因子后诱导神经前体细胞分化。利用流式细胞仪检测神经球内细胞的增殖细胞周期。结果 人胚胎皮层存在神经前体细胞,这些细胞于EGF及bFGF作用下可不断增殖形成神经球,并能自我更新和结合BrdU,于生长因子去除后能够分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。反复传代后这些细胞可保持其增殖及分化能力。细胞周期结果显示神经球内细胞增殖较为活跃。结论 从人胚胎中分离的细胞能于体外自我更新和分化为成熟的细胞,证实为神经前体细胞。     

高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生SD大鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的探讨在离体细胞水平下高压氧(HBO)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)时新生SD大鼠神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法采用Rice-Vannucci法制成HIBD模型,分别制备正常及HIBD时SD大鼠脑组织匀浆,将传至2～3代的SD大鼠NSCs根据处理的不同随机分为空白对照组(CON组)、与正常脑组织匀浆共培养组(NC+N组)、与HIBD脑组织匀浆共培养组(NC+HIBD组)、与HIBD脑组织匀浆共培养1h后给予HBO处理组(NC+HIBD+HBO组)和与正常脑组织匀浆共培养1h后给予HBO处理组(NC+N+HBO)5组。5组细胞在同一时间行免疫荧光染色,分别进行NSE、GFAP、O4染色,荧光显微镜下计数各组NSCs分化为NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞和O4阳性细胞的百分率,并进行比较。结果与CON组相比,NC+N+HBO组、NC+N组、NC+HIBD组分化为神经元和少突胶质细胞的百分比明显增加(P<0.05),其中HIBD组增加最多,在此基础上再给予HBO处理,NSCs向神经元的分化会进一步增加,向少突胶质细胞的分化也相应增加;与CON组相比,NC+N组、NC+HIBD组、NC+HIBD+HBO组分化为星形胶质细胞的百分比明显减少(P<0.05)。结论在离体细胞水平,HBO可促进HIBD大鼠NSCs分化为神经元和少突胶质细胞而抑制其向星形胶质细胞分化。     

去分化人脐带间充质干细胞通过重编程基因表达参与缺氧缺血性脑损伤大鼠神经修复

目的：探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）、神经分化hUC-MSCs（Dif）、神经去分化hUC-MSCs（De-Dif）及神经再分化hUC-MSCs（Re-Dif）4种状态的细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-is－chemic brain damage,HIBD）大鼠治疗效果,期望找寻治疗效率更优的种子细胞。方法：体外培养hUC-MSCs,按MNM成神经诱导方法进行神经分化、去分化、再分化诱导,通过对4种状态细胞光镜下形态观察及全基因表达谱芯片分析;移植入HIBD神经损伤动物体内,进行功能学检测;应用基因和蛋白检测手段,对最优种子细胞进行可能机制探讨。结果：hUC-MSCs在体外可成功进行神经分化、去分化、再分化诱导;全基因表达谱芯片发现,诱导过程中hUC-MSCs、Dif、De-Dif及Re-Dif 4种状态细胞基因进行重编程表达,De-Dif与hUC-MSCs基因表达模式最相近;将4组细胞移植入HIBD实验大鼠体内,发现4种细胞均可促进HIBD大鼠神经功能恢复,但De-Dif较其他3组细胞发挥更大的神经修复潜能,差异具有统计学意义（P=0.000）;对hUC-MSCs与De-Dif 2组间进行GO生物学功能分析,发现De-Dif主要参与缺氧反应;De-Dif组较hUC-MSCs组高表达神经标志物MAP2、NSE、Tau、β-tubulinⅢ,干性基因C-MYC、NANOG和视黄酸核受体RARβ。结论：去分化过程可能通过重编程调控神经标志物基因MAP2、NSE、Tau、 β-tubulinⅢ,干性基因C-MYC、NANOG及RARβ基因表达,促进De-Dif参与HIBD神经修复。     

胚胎干细胞源性与海马源性神经干细胞培养与分化的特性比较

【目的】探讨胚胎干细胞(ESCs)源性神经干细胞(NSCs)与海马源性NSCs的培养条件与分化特性,并进行比较研究。【方法】将拟胚体阶段视黄酸及视网膜Muler细胞诱导的ESCs和自60只BALB/c胎鼠海马组织分离的细胞(每次实验取10只),分别在NSCs选择性培养基中进行NSCs培养筛选,观察细胞形态变化,RT-PCR法检测Nestin基因表达,免疫细胞化学法检测Nestin等NSCs特异性标志物,对其分化后细胞检测Map2、Gap43、NF200、S100、GFAP神经组织细胞标志抗原,并对6次诱导结果进行观察比较。【结果】初级诱导的ESCs及海马细胞,在NSCs选择性培养基中培养,均形成大量呈Nestin抗原阳性,整合BrdU,表达Nestin基因的神经球样结构,且具有体外扩增传代及分化为神经元及神经胶质样细胞的能力。但ESCs源性NSCs增殖力更强,且分化细胞中NF200阳性细胞率42.1％±3.6％高于海马源性NSCs分化细胞中NF200阳性细胞率18.7％±5.1％,P<0.01。【结论】体外诱导可获得ESCs源性NSCs,与海马源性NSCs相比有更强的增殖力和向神经元分化的潜能,可作为干细胞移植治疗青光眼等神经变性疾病研究新的种子细胞。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

Duchenne肌营养不良模型鼠肌肉内移植小鼠胚胎干细胞后分化潜能的初步研究

目的 研究Duchenne肌营养不良模型鼠(mdx鼠)局部肌肉内鼠胚胎干细胞(ESCs)移植治疗后,ESCs的分化、肌肉病理改变及dystrophin蛋白表达变化.方法 eGFP标记的ESCs局部肌肉注射移植入mdx鼠,4周后观察核内移及dystrophin蛋白表达变化.结果 移植后4周mdx鼠核内移改善不明显,dystrophin蛋白阳性表达及肌纤维增加均不明显.结论 局部肌肉内胚胎干细胞移植治疗mdx鼠效果不明显.胚胎干细胞移植后分化为骨骼肌细胞的比例低.     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

胚胎大鼠海马神经干细胞分离培养和分化

目的：研究胎鼠脑海马组织去掉的神经干细胞的分离、培养、增殖及分化特点。方法：采用无血清培养、单细胞克隆技术及免疫细胞化学方法，观察海马源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：从大鼠胚胎脑海马分离的细胞具有增殖能力，可以传代培养，子代细胞免疫组化显示神经巢蛋白(nestin)阳性。经含血清培养基培养，贴壁可分化为微管相关蛋白-2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。结论：用本方法分离培养的细胞具有自我复制和多向分化的能力，是中枢神经系统的干细胞。     

体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

[目的]探索体外定向诱导人胚胎干细胞(hES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。[方法]将人胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4~5 d,观察其形态变化并分别用β1整合素,CK15及CK19免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。[结果]人胚胎干细胞与人羊膜共培养4～5 d后,在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落,表达高水平的表皮干细胞特异标记物β1整合素、CK15和CK19。在无羊膜覆盖处,细胞贴壁生长,形成单层表皮样细胞,细胞呈多边形,排列紧密,大部分细胞表达β1整合素。对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞。[结论]在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞,而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和分化

探索大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和传代等方法,并用血清促使分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞;在无血清条件下,对神经干细胞进行培养、传代;用神经上皮干细胞蛋白（Nestin）对神经干细胞进行箍定;用免疫荧光方法对分化后神经干细胞进行神经纤维丝蛋白（NF68）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂（Gale）染色。结果成功得到神经干细胞,并且进行多次传代培养。血清能促使其分化成为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下能大量增生,并且具有多向分化潜能。