组蛋白去乙酰化抑制剂SBHA对急性髓细胞白血病细胞的杀伤作用

目的:观察组蛋白去乙酰化抑制剂suberic bishydroxamate( SBHA)对人急性髓系白血病(AML)细胞株的杀伤作用.方法:将不同浓度的SBHA分别作用于对数生长期的AML细胞24 h,MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡率,Westernblot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变.结果:SBHA能显著抑制AML细胞株U937ˉ、KG-1及Kasumi-1细胞的生长.AnnexinV-PI双标记法及FACS分析结果证实,SBHA能显著诱导白血病细胞的凋亡,激活Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8,下调抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl的表达,下调Survivin、XIAP及cIAP的表达.结论:组蛋白去乙酰化抑制剂SBHA能显著抑制人AML细胞株的增殖、促进其凋亡,对凋亡相关蛋白的调控是其作用机制之一.     

小分子靶向药物治疗急性髓系白血病的研究现状和展望

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤。联合化疗即使是高剂量联合化疗和造血干细胞移植也不能显著改善AML的预后,特别是高危患者。近年来,随着对AML细胞和分子遗传学、白血病干细胞(LSC)和细胞信号途径等方面的深入研究,新的小分子靶向药物不断涌现。一些小分子靶向药物治疗难治、复发或老年AML已取得令人鼓舞的效果,但是单用小分子靶向药物治疗其完全缓解(CR)率不高。因此,应重视开展小分子靶向药物治疗AML的临床研究。     

Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用

目的:观察Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病(AML)细胞株的杀伤作用.方法:将不同浓度的ENMD-2076分别作用于对数生长期的AML细胞24 h、48 h,采用MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡率,Western blot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变.结果:ENMD-2076能显著抑制AML细胞株THP-1和Kasumi-1的生长(P ＜0.001),24 h时对THP-1和Kasumi-1的半数抑制浓度分别是9.32μmol/L和7.23 μmol/L.Hoechst荧光染色证实ENMD-2076能使THP-1细胞发生染色质浓缩等凋亡改变.Western blot检测证实,ENMD-2076能激活Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8和PARP,上调促凋亡蛋白Bak、Bax、Bad和Bim,下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达.结论:Aurora激酶抑制剂ENMD-2076能显著抑制人AML细胞株THP-1和Kasumi-1的增殖并促进其凋亡,对凋亡相关蛋白的调控是其作用机制之一.     

白血病干细胞及白血病靶向治疗研究进展

<正>1白血病干细胞起源早在20世纪70年代,Park等[1]的研究已清楚地表明,在白血病细胞中,仅仅只有很小一部分具有无限增殖、分化潜力的细胞,但起着重要作用。Bonnet等[2]经过大量研究发现,CD34+CD38—与正常造血干细胞(HSC)表面标志相似,可用来鉴别急性髓系白血病(AML)中具有无限增殖、分化能力的细胞,研究表明虽然该类细胞群在AML患者体内所占的比例很少,但它们却是唯一将人类AML     

急性髓系白血病干细胞免疫表型和信号通路蛋白活化检测及意义

目的为了解急性髓系白血病干细胞(AML-LSCs)免疫表型特点和信号转导通路活化状态,以探讨其生物学特征。方法应用流式细胞术检测(AML-LSCs)免疫表型、P-gp、PTEN、p-Akt、p-ERK的表达,以正常造血干细胞(HSCs)为对照。结果正常HSCs主要免疫表型:CD34+、CD38-、CD123-、CD96-、CD117+、CD44+、、CD33-、CD13-。PTEN蛋白阳性率为72.09%,p-Akt及p-ERK蛋白均阴性,P-gp蛋白阴性。AML-LSCs主要免疫表型:CD123+、CD96+、CD117-、CD44+、CD13+、CD33+,与HSCs免疫表型差异主要为CD123+、CD96+、CD117-、CD13+、CD33+。LSCs PTEN蛋白阳性率为25.58%,低于正常HSCs(χ2=30.88,P<0.01),p-Akt阳性率为63.95%,p-ERK阳性率为70.93%,高于正常HSCs(χ2=24.43、30.87,P均<0.01)。P-gp蛋白阳性率为67.44%。79例AML患者预后分析表明,高AML-LSCs的患者较低AML-LSCs患者复发率增高(χ2=5.69,P<0.05);无病生存率(DFS)分析显示,高AML-LSCs的患者无病生存时间中位数14个月,较低AML-LSCs患者无病生存时间中位数28个月明显缩短(P<0.01)。结论 LSCs免疫表型特征为CD34+、CD38-、CD123+、CD96+、CD117-,P-gp高表达。AML-LSCs数量高的AML患者复发率高、无病生存时间短、预后差。MEK/ERK,PI3K/PTEN/Akt信号通路被激活,可能与LSCs克隆性增殖和自我更新有关。     

急性髓系白血病患者白血病细胞CD34和CD38抗原的表达及其临床意义

目的:探讨初诊急性髓系白血病(AML)患者白血病细胞CD34和CD38抗原表达与预后的关系,阐明CD34和CD38抗原表达在预测AML患者预后中的作用。方法:收集初诊AML患者94例,采用流式细胞术检测AML患者白血病细胞CD34和CD38抗原的表达,依据CD38抗原表达将患者分为CD34⁺ CD38^-组(n=36)和CD34⁺CD38⁺组(n=58)。2组患者诱导方案均为IA方案。比较2组患者完全缓解率(CRR)、复发率、中位总生存时间(OS)、中位无病生存时间(DFS)和生存率。结果:CD34⁺ CD38^-组患者CRR为77.8%,CD34⁺CD38⁺组为86.2%,2组患者诱导治疗后CRR比较差异无统计学意义(P>0.05);CD34⁺ CD38^-组患者总复发率和1年内复发率(53.8%和36.0%)均高于CD34⁺CD38⁺组(27.9%和14.3%)(P<0.05);CD34⁺ CD38^-组患者中位OS(13.60个月)小于CD34⁺CD38⁺组(20.33个月)(P<0.05);CD34⁺ CD38^-组患者中位DFS(12.87个月)小于CD34⁺CD38⁺组(33.93个月)(P<0.05)。CD34⁺ CD38^-组患者1年和2年生存率(52.8%和38.9%)低于CD34⁺CD38⁺组(75.9%和48.3%)(P<0.05)。结论:白血病细胞CD34⁺ CD38^-抗原的表达为初诊AML患者提供一个新的预后指标,表达CD34⁺ CD38^-抗原患者预后不良。     

嵌合型溶瘤腺病毒SG235体外对白血病细胞抑制作用的实验研究

目的:研究嵌合型溶瘤腺病毒(CRAd)SG235的抗白血病作用.方法:用流式细胞术(FACS)检测原代白血病细胞CD46的表达和SG235对多种白血病细胞株的感染率,MTT法研究SG235对Kasumi-1细胞的生长抑制,Annexin-V/PI染色和TUNEL法观察SG235诱导白血病细胞凋亡的作用,Western blot检测CRAd对磷酸化Akt蛋白表达的影响.结果:大多数急性白血病患者原代白血病细胞表达CD46.用50病毒感染复数(MOI)的SG235-EGFP感染Mutz-1、Kasumi-1、K562、HL60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat细胞,感染率分别为45.1%、35.7%、54.2%、37.0%、30.1%、67.1%、17.2%、33.1%.SG235对Kasumi-1细胞有显著的生长抑制作用,作用24 h和48 h IC50值分别为79.0 MOI、38.4 MOI.SG235能诱导多种白血病细胞株凋亡,而且呈剂量依赖性;并能抑制Kasumi-1细胞磷酸化Akt活性.结论:嵌合型溶瘤腺病毒SG235能有效地感染白血病细胞,并能抑制白血病细胞的生长,诱导其凋亡.     

CD47在急性髓细胞白血病干细胞中的表达及其临床意义探讨

目的探讨CD47在急性髓细胞白血病干细胞(AML LSCs)中的表达及临床意义。方法应用流式细胞仪检测19名健康对照者骨髓造血干细胞(HSC)及147例AML患者骨髓LSCs中CD47的表达。对其中131例AML患者进行跟踪随访,分析LSCs CD47阳性和阴性对AML预后的影响。结果 19名健康对照骨髓HSC CD47阳性4例(21.05%),147例AML患者LSCs CD47阳性112例(76.19%),明显高于对照组,差异有统计学意义(χ2=24.30,P<0.01)。CD47在LSCs中表达百分率和平均荧光强度(MFI)均高于CD34+CD38+亚群(U值分别为4.90、3.03,P均<0.01)。对131例AML进行1～31个月随访:CD47阳性的AML患者复发率为46.46%(46/99),病死率为43.43%(43/99),CD47阴性的AML患者复发率为25.00%(8/32),病死率为18.75%(6/32),两者差异有统计学意义(χ2值分别为4.60、6.29,P均<0.05)。生存分析显示,CD47阳性的AML患者平均生存时间18.99±1.15个月,CD47阴性的AML患者平均生存时间24.90±1.87个月,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LSCs CD47阳性的AML患者易复发、病死率高、生存时间短、预后差。     

白血病K562/ADM细胞耐药性与白血病干细胞及耐药蛋白表达的关系

目的 观察白血病药物敏感和耐受细胞中白血病干细胞(ISC)、耐药蛋白表达和耐药性的关系.方法 以白血病多药耐药株K562/ADM细胞及其亲本K562细胞为模型,MTT比色法测定细胞的药物耐受性;流式细胞术检测细胞免疫标志、P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达;甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖潜能.结果 K562/ADM细胞对阿霉素、柔红霉素和鬼臼乙叉苷高度耐受.K562/ADM细胞中CD34+、CD123+和CD34+CD38-细胞含量均显著高于K562细胞,LSC细胞相对含量是K562细胞的4.12倍;共表达P-gP和BCRP的K562/ADM细胞比K562细胞高11.25倍,其中CD34+ CD38- CD123+ BCRP+和CD34+ CD38- P-gp+ BCRP+细胞数量分别为K562细胞的3.66倍和11.37倍.K562/ADM细胞集落形成率是K562细胞的4.17倍,与LSC含量相当.结论 白血病K562/ADM耐药细胞中存在的高表达耐药蛋白的耐药性LSC是其多药物耐受性的根源.     

CD34~+细胞在急性髓细胞白血病骨髓组织中的表达研究

目的:探讨CD34+细胞在急性髓细胞白血病骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学染色法,检测急性髓细胞白血病患者初发未治及标准化疗后完全缓解时骨髓组织中CD34+细胞的表达情况。结果:急性髓细胞白血病初发未治组骨髓组织中CD34+细胞阳性表达率与完全缓解组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD34+细胞与急性髓细胞白血病的发生、发展及预后存在一定关联。     

高三尖杉酯碱联合JQ1对急性髓系白血病细胞株Kasumi-1、Mv4-11的凋亡诱导作用

目的探讨高三尖杉酯碱（HHT）联合BRD4抑制剂JQ1对急性髓系白血病（AML）细胞株Kasumi-1、Mv4-11的凋亡诱导作用。方法MTS法测HHT、JQ1单药及两药联合对AML细胞株的抑制作用,流式细胞仪检测两药联合对AML细胞株凋亡的作用,Westernblot法检测两药联合对凋亡相关蛋白（Bcl-2、Caspase-3、Parp）的作用。结果与HHT、JQ1单药比较,两药联合的抗白血病效应明显增强,能明显抑制AML细胞株Kasumi-1、Mv4-11的增殖;可促进细胞凋亡作用,并明显抑制Bcl-2蛋白表达,激活Caspase-3,促进Parp的裂解。结论HHT联合JQ1可以增强抗AML细胞株的作用,促进AML细胞株的凋亡,是有效的联合方案。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合伊马替尼对K562细胞的协同杀伤作用

目的:观察组蛋白去乙酰化酶( HDAC)抑制剂SAHA联合伊马替尼(imatinib,IM)对人慢性髓系白血病(CML)细胞株的协同杀伤作用,并探讨其分子学机制.方法:将不同浓度的SAHA和IM分别或联合作用于对数生长期的K562细胞,MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用Hoechst荧光染色法和流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡,Western blot法检测药物处理后Bcr-Abl及其下游信号途径蛋白的表达、Caspase途径活化和凋亡相关蛋白表达的改变.结果:SAHA和IM单独作用K562细胞呈剂量依赖性抑制细胞生长(SAHA:F=433.8,P＜0.001;IM:F =54.14,P＜0.001);两药联合对细胞的生长有协同杀伤作用,联合指数CI＜1.FACS分析和Hoechst荧光染色证实,SAHA和IM两药联合能加速K562细胞的凋亡,激活Caspase-3、Caspase-8和PARP,下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达.此外,SAHA和IM联用能抑制Bcr-Abl及其磷酸化水平,下调JAK2和磷酸化STAT5表达.结论:HDAC抑制剂SAHA联合IM能协同杀伤CML细胞、加速细胞凋亡.其作用机制可能是两药联用协同抑制了Bcr-Abl及其磷酸化水平,抑制JAK2/STAT5信号途径和下调下游靶基因Mcl-1.     

Lower Phosphorylation of p38 MAPK Blocks the Oxidative Stress-induced Senescence in Myeloid Leukemic CD34~+CD38~- Cells

Leukemia seems to depend on a small population of "leukemia stem cells (LSCs)" for its growth and metastasis. However, the precise surviving mechanisms of LSCs remain obscure. Cellular senescence is an important obstacle for production and surviving of tumor cells. In this study we investigated the activated state of a pathway, in which reactive oxygen species (ROS) induces cellular senescence through DNA damage and phophorylation of p38 MAPK (p38), in myeloid leukemic CD34+CD38- cells. Bone marrow samples were obtained from patients with acute myeloid leukemia (AML, n=11) and chronic myeloid leukemia (CML, n=9). CD34+CD38- cells were isolated from mononuclear cells from these bone marrow samples, and K562 and KG1a cells (two kinds of myeloid leukemia cell lines) by mini-magnetic activated cell sorting. Hematopoietic stem cells (HSCs) from human cord blood served as controls. Intracellular ROS level was detected by flow cytometry. DNA damage defined as the γH2AX level was measured by immunofluorescence staining. Real-time RT-PCR was used to detect the expression of p21, a senescence-associated gene. Western blotting and immunofluo-rescence staining were employed to determine the p38 expression and activation. The proliferation and apoptosis of CD34+CD38- cells were detected by MTT assay and flow cytometry. Our results showed that ROS and DNA damage were substantially accumulated and p38 was less phosphorated in myeloid leukemic CD34+CD38- cells as compared with HSCs and H2O2-induced senescent HSCs. Furthermore, over-phosphorylation of p38 by anisomycin, a selective activator of p38, induced both the senescence-like growth arrest and apoptosis of CD34+CD38- cells from K562 and KG1a cell lines. These findings suggested that, although excessive accumulation of oxidative DNA damage was present in LSCs, the relatively decreased phosphorylation of p38 might help leukemic cells escape senescence and apoptosis.     

急性白血病患儿白血病干细胞表面CD96和CD71的表达对其疗效和预后的影响

目的：观察白血病干细胞（LSC）表面CD96和CD71表达对急性白血病患儿疗效及预后的影响,阐明白血病患儿LSC的分子生物学特征与其疗效和预后的关联性。方法：选择80例急性白血病患儿作为研究对象,其中急性淋巴细胞白血病（ALL）39例,急性髓系白血病（AML）41例。应用流式细胞术对其LSC表面CD96和CD71表达情况进行检测,对患者的首次化疗疗效、5年生存率、化疗后感染、化疗后复发和髓外浸润发生率进行观察和比较。结果：38例（47.5%）患儿LSC表面CD96阳性表达,45例（56.3%）患儿LSC表面CD71阳性表达,2种抗原阳性表达率比较差异无统计学意义（χ²=1.227,P=0.268）;AML患儿LSC表面CD96和CD71阳性表达率均明显高于ALL患儿（χ²=22.225,χ²=34.028,均P<0.01）。LSC表面CD96阴性表达患儿首次化疗后的临床有效率和疗效分布均优于LSC表面CD96阳性表达患儿,LSC表面CD71阴性表达的患儿首次化疗后的临床有效率和疗效分布优于LSC表面CD71阳性表达患儿（χ²=11.323,χ²=16.589,P<0.05;U=2.939,U=2.291,P<0.05）。LSC表面CD96阴性表达患儿的5年生存率明显高于LSC表面CD96阳性表达患儿（χ²=5.051,P<0.05）,化疗后感染、化疗后复发和髓外浸润发生率明显低于LSC表面CD96阳性表达患儿（χ²=8.316,χ²=13.288,χ²=5.389,均P<0.05）;LSC表面CD71阴性表达患儿化疗后感染发生率和化疗后复发率明显低于LSC表面CD71阳性表达的患儿（χ²=6.622,χ²=10.787,均P<0.05）。结论：急性白血病患儿LSC表面的CD96和CD71表达水平与疾病亚型、首次化疗疗效具有一定的关联性,可作为辅助诊断和评价疗效的标志物;CD96的表达水平与患者的预后具有关联性,可作为预测患儿预后的指标。     

三尖杉酯碱通过下调Mcl-1蛋白诱导NB4细胞凋亡

［摘要］目的：考察三尖杉酯碱（HT）对人急性早幼粒白血病（APL）细胞株NB4细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用,并探讨其杀伤白血病细胞的作用机制。方法：采用台盼兰染色法,细胞计数,考察HT对NB4细胞的生长抑制作用和细胞毒性作用;采用AO-EB荧光染色法和细胞形态学观察,考察HT对NB4细胞的凋亡诱导作用;采用PI染色的流式细胞术,考察HT对NB4细胞的凋亡诱导作用;采用Western Blotting技术,考察HT对NB4细胞凋亡相关蛋白的影响;采用siRNA干扰技术,沉默目的蛋白证明推论;提取APL患者血液样本,验证HT的凋亡诱导作用及作用机制。结果：HT能够呈剂量依赖和时间依赖地抑制NB4细胞生长并杀伤NB4细胞,HT处理72h后GI50为（32.0±2.5） nmol/L;HT能够呈现剂量依赖和时间依赖的诱导NB4细胞凋亡,HT处理6h后其诱导凋亡百分率为66%;HT诱导NB4细胞凋亡,引起PARP蛋白裂解,并不下调Bcl-2,不影响Bax和Bak的表达,但显著下调Mcl-1蛋白水平;siRNA沉默Mcl-1的蛋白表达可以显著提高HT对NB4细胞的凋亡诱导作用;HT诱导APL患者白血病样本细胞凋亡,并下调Mcl-1蛋白。结论：HT通过抑制细胞生长和诱导细胞凋亡杀伤NB4细胞,HT可能通过下调Mcl-1蛋白发挥诱导NB4细胞凋亡的抗白血病作用。     

低浓度雷公藤内酯联合伊达比星在急性髓系白血病干细胞凋亡中的作用

目的 研究IC20浓度(5 nmoL/L)的雷公藤内酯(TPL)联合IC50浓度(27 nmol/L)的伊达比星(IDA)能否通过下调MDR1基因表达水平诱导急性髓系白血病(AML)干细胞凋亡.方法 从KG1a细胞株中分选CD34+ CD38-亚群,将其作为AML干细胞模型;分成空白对照组、TPL组、IDA组、联合组.空白对照组:培养液中不合TPL及IDA;TPL组:培养液中含IC20浓度(5 nmoL/L)的TPL;IDA组:培养液中合IC50浓度(27 nmoL/L)的IDA;联合组:培养液中含IC20浓度(5 nmoL/L)的TPL及IC50浓度(27 nmoL/L)的IDA.Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测处理后AML干细胞的凋亡情况;RT-PCR法检测上述4组中AML干细胞MDR1 mRNA表达水平的变化;Western blot检测上述4组AML干细胞给药后MDR1蛋白表达水平的变化.结果 空白对照组、TPL组、IDA组及联合组中AML干细胞在处理24 h后凋亡率分别为(0.37±0.29)％、(18.07±0.32)％、(20.13±0.06)％和(60.17±1.45)％,联合组中AML干细胞凋亡比例显著高于TPL组及IDA组,差异有统计学意义(P＜0.001).RT-PCR结果显示TPL组、IDA组及联合组中AML干细胞内MDR1 mRNA表达水平均有不同程度下调,空白对照组、TPL组、IDA组及联合组中MDR1 mRNA表达水平分别为0.927±0.084、0.462±0.048、0.396±0.019和0.231±0.023,联合组MDR1 mRNA表达水平均显著低于TPL组及IDA组,差异有统计学意义(P＜0.001).Western blot结果显示TPL组、IDA组及联合组AML干细胞内MDR1蛋白表达水平均不同程度下调,其中联合组更加明显.结论 IC20浓度的TPL可显著提高IC50浓度的IDA对AML干细胞的凋亡诱导作用,其机制可能与抑制MDR1基因及蛋白的表达有关.