pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用

目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用。结果通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中。结论成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合。     

VEGF-C真核表达质粒的构建及其真核表达

目的　研究人血管内皮生长因子 C(VEGF- C)基因功能片段的表达功能及表达活性。方法　以前期从人舌癌克隆得到的 VEGF- C功能片段 c DNA和真核表达质粒 pc DNA3.1( )构建重组质粒 ,以阳离子脂质体转染法将其导入舌鳞癌细胞 Tca8113,并检测其表达、分泌功能及体外激活能力。结果　通过将长度约为 110 0 bp的VEGF- C功能片段插入 pc DNA3.1( )的 Eco R 和 Xho 酶切位点之间 ,成功构建出 pc DNA3.1( ) - VEGF- C重组质粒 ,该质粒转染 Tca8113细胞后得到 VEGF- C高表达的舌癌细胞 Vc Tca,转染后的细胞可表达相对分子质量为 5 3× 10 3和 2 9× 10 3的 VEGF- C分子 ,在细胞培养液中可检测到相对分子质量为 2 9× 10 3的 VEGF- C片断。结论　构建的 VEGF- C重组质粒可在真核细胞实现表达 ,并能被分泌和激活     

pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。...     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的真核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增HCV结构基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中,用磷酸钙转染法将其转入Sp2/0细胞,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白.结果:克隆的基因片段全长约1.9kb,包括C及E2的全长和E1的部分.免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中.结论:构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达,为进一步研究HCV结构蛋白的性质及各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果奠定了基础.     

乙肝病毒核心蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建2种包含乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的真核表达载体,检测其在人肝癌细胞系BEL7402中的表达.方法 以质粒pUC19/3.0HBV作为模板,PCR扩增HBc基因,分别以pcDNA3.0和pEGFP-N1为母本,构建含HBc基因的真核表达载体pcDNA-HBc-HA及pEGFP-HBc.通过单、双酶切、PCR及DNA测序鉴定其正确性.利用脂质体将其分别转染入人肝癌细胞系BEL7402,并采用RT-PCR、Western blot及荧光显微镜观察的方法,分别检测其mRNA、蛋白质水平的表达.结果 获得与预期分子量大小一致的DNA片段,转染2种质粒的BEL7402细胞均可高水平表达HBc mRNA,而空载体转染组则无表达,转染pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组,均有较强的绿色荧光表达,pcDNA-HBc-HA转染组细胞可检测到HBc-HA融合蛋白的表达.结论 成功构建2种携栽HBc基因的真核表达载体,并可在人肝癌细胞系BEL7402中有效表达.     

大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

目的:利用AdEasy~(TM) system构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达.方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定.经Not I和Hind Ⅲ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7.EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasy~(TM)DNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌, 抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度.用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和Western-blot法检测BMP(-7)在大鼠肾小管上皮细胞中的表达.RT-PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性.结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液.该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高.结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能.     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌.方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌 E.coli DH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达.结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)大小为894 bp, 编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带.以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),在得到的转化子 E.coli BL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导.在N-乙酰(-D)-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2％,总回收率为70.6%.全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征.结论:所构建的诱导型产酶菌株 E.coli BL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株 E.coli DH5α/pRY3都可较多量的产酶.合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征.     

CXCL12及CXCR4基因多态性与冠心病发病风险和冠状动脉狭窄程度的相关性

目的: 探究甘肃省汉族人群CXC型趋化因子配体12（CXCL12）及其受体趋化因子受体4（CXCR4）rs2297630和rs2322864位点基因多态性与冠心病发病风险以及冠状动脉狭窄程度的相关性。方法: 2017年11月至2018年6月在兰州大学第二医院住院治疗的302例无血缘关系的冠心病患者作为冠心病组,同期年龄、性别相匹配的302名无血缘关系的体检者作为健康对照组。应用竞争性等位基因特异性PCR法检测所有研究对象rs2297630和rs2322864位点的基因分型,并根据冠状动脉造影结果采用Gensini评分对患者冠状动脉狭窄程度进行评价。采用二元Logistic回归分析和多因素线性回归分析rs2297630和rs2322864基因多态性与冠心病发病风险和冠状动脉狭窄程度的相关性。结果: 冠心病组与健康对照组rs2297630和rs2322864等位基因和基因型分布频率差异均具有统计学意义（均P < 0.01）;rs2297630与冠心病的发病风险和冠状动脉病变狭窄程度均相关（均P < 0.01）,AA基因型者冠心病的发病风险和冠状动脉狭窄严重程度增加（均P < 0.01）。rs2322864与冠心病的发病风险相关（P < 0.01）,CT基因型会增加冠心病的发病风险（P < 0.01）,但与冠状动脉狭窄程度不相关（P>0.05）。结论: 甘肃省汉族人群中CXCL12多态性位点rs2297630与冠心病的发病风险和冠状动脉狭窄程度相关,其受体CXCR4上的常见突变位点rs2322864也与冠心病的发病风险相关,但与冠状动脉狭窄程度不相关。     

晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的构建晚期糖基化终末产物受体(RAGE)胞外段不同功能段V/VC1真核细胞表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法采用PCR方法扩增RAGE不同功能段V/VC1的序列,利用分子克隆技术将其重组于pcDNA3-HA载体中。利用PCR和测序鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western blotting检测其表达,免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果克隆的RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体完全正确,Western blotting检测到RAGE不同功能段V/VC1的表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞浆中。结论成功地构建了RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体,其能够在PC-3细胞中表达。     

人microRNA-21真核过表达载体的构建及其在 HepG2．2．15细胞中上调c-myc基因的表达

目的：构建人微小RNA‐21（microRNA‐21,miRNA‐21）真核过表达载体pmR‐21,探讨其在 HepG2．2．15细胞中对c‐myc基因表达的调控作用。方法 PCR扩增miRNA‐21的前体基因片段（pre‐miRNA‐21）,双酶切后连接到pmR‐mCherry载体上,通过双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到 HepG2．2．15细胞中为实验组,另设空载体组（转染 pmR‐mCherry空质粒组）,空白组（未转染组）,阳性对照组（HepG2细胞）,24 h后观察载体荧光蛋白表达情况,流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR评估miRNA‐21的表达情况;转染72 h后,RT‐PCR和Western blot检测c‐myc mRNA及蛋白表达水平;CCK‐8法检测各组细胞增殖情况。结果经双酶切和测序验证,目的基因片段插入载体中;实验组及空载体组转染24 h后细胞内可见强荧光,转染效率大于50％;实验组细胞 miRNA‐21表达较空载体组、空白组水平升高;转染72 h后实验组细胞c‐myc mRNA表达较空载体组、空白组升高;实验组细胞增殖快于空载体组及空白组,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论成功构建miRNA‐21真核过表达载体 pmR‐21,该重组载体可稳定表达 miRNA‐21;miRNA‐21可上调 c‐myc基因的表达,c‐myc基因是miRNA‐21发挥促癌作用的靶点之一。     

人HSP_(70)真核表达载体的构建及在大鼠胶质瘤细胞内的表达

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,并在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中进行表达。方法:构建了HSP70与PCDNA3.1真核表达载体pCDNA3.1-HSP70,以脂质体法转染,同时利用免疫组织化学方法检测HSP70在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中进行表达。结果:成功地构建了真核表达载体pCDNA3.1-HSP70,采用脂质体法转染大鼠胶质瘤C6细胞后,成功检测到HSP70在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中表达。结论:成功地将外原性HSP70基因转染到大鼠胶质瘤C6细胞中并进行表达,为HSP70在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验材料。