以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌蛋白抗原对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的探讨以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌（脚）抗原对脚感染的免疫保护作用。方法BALB／c小鼠随机分为9组：（1）空白对照组：PBS溶液；（2）壳聚糖酸溶液组；（3）壳聚糖颗粒组；（4）印抗原组；（5）np抗原＋壳聚糖酸溶液组；（6）Hp抗原＋壳聚糖颗粒组；（7）Hp抗原＋CT组；（8）脚抗原＋壳聚糖酸溶液＋CT组；（9）Hp抗原＋壳聚糖颗粒＋CT组。各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周给予109CFUIml的SSlnp菌液0．5ml／只进行攻击，隔日1次，共2次。4周后，采用定量砌培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内伽感染情况。结果（1）以壳聚糖为佐剂的印抗原的免疫保护率达60％，与以凹为佐剂的伽抗原的免疫保护率（58．33％）相似，显著高于单纯印抗原组及其他不含印抗原组（P〈0．05），同时以凹＋壳聚糖为佐剂的坳疫苗的保护率为84．62％、85．71％，高于CT或壳聚糖单独作佐剂组。（2）病理组织学检测含佐剂组的铷定植计分显著低于无佐剂组和无抗原组（P〈0．05），壳聚糖和CT联合应用组的跏定植计分最低，显著低于单以CT为佐剂组（P〈0．05）。（3）砌定量培养脚定植密度在佐剂中含壳聚糖组均显著低于对照组和单纯脚抗原组（P〈0．05），而单以CT为佐剂组脚定植密度与对照组和单纯坳抗原组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论以壳聚糖为佐剂的坳抗原对Hp感染具有免疫保护作用，并且与CT有协同作用。     

以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗诱导的细胞免疫反应

目的:探讨以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌(Hp)疫苗诱导的细胞免疫反应及其在免疫保护中的作用。方法:BALB/c小鼠随机分为空白对照组(PBS溶液)、壳聚糖酸溶液组、壳聚糖颗粒组、Hp抗原组、Hp抗原 壳聚糖酸溶液组、Hp抗原 壳聚糖颗粒组、Hp抗原 霍乱霉素(CT)组、Hp抗原 壳聚糖酸溶液 CT组及Hp抗原 壳聚糖颗粒 CT组,各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,末次免疫后4周给予1×1012CFU/L的SS1Hp菌液0·5mL/只进行攻击,隔日1次,共2次。在攻击前后分批处死小鼠,采用Hp培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内Hp感染。用定量ELISA法检测胃黏膜内IL-2、IL-4和IL-10含量;HE染色进行胃黏膜病理学检测。结果:①以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率达60%,与以CT为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率(58·33%)相似,显著高于单纯Hp抗原组及其他不含Hp抗原组(P<0·05)。②胃黏膜内IL-2的水平攻击后含佐剂组显著高于对照组(P<0·05)。IL-10水平攻击前以壳聚糖为佐剂组高于无佐剂组,攻击后以CT 壳聚糖颗粒为佐剂组高于其他组(P<0·05)。IL-4水平攻击前以壳聚糖为佐剂组高于无佐剂组(P<0·05),攻击后以壳聚糖颗粒为佐剂组高于以CT为佐剂组(P<0·05),以壳聚糖溶液为佐剂组高于对照组、无佐剂组及佐剂中含CT组(P<0·05)。③胃黏膜炎症程度在单纯壳聚糖组和以壳聚糖颗粒为佐剂组显著低于以CT为佐剂组(P<0·05)。结论:①以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗对Hp感染具有免疫保护作用。②以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗可促进Th1和Th2的混合免疫反应,并逆转Hp感染所致Th2反应的抑制,使Th1和Th2反应达到平衡,从而发挥其免疫保护作用。③以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗所致的免疫后胃炎显著低于以CT为佐剂的Hp疫苗。     

以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗诱导的体液免疫应答及其免疫保护效应

目的：探讨以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护作用及其机制。方法:BALB/c小鼠随机分为9组：①空白对照组：PBS溶液；②壳聚糖酸溶液组；③壳聚糖颗粒组；④Hp抗原组；⑤Hp抗原+壳聚糖酸溶液组；⑥Hp抗原+壳聚糖颗粒组；⑦Hp抗原+CT组；⑧Hp抗原+壳聚糖酸溶液+CT组；⑨Hp抗原+壳聚糖颗粒+CT组，各组于第0、7、14、21 d 灌胃各免疫1次，免疫后4周给予1×1012CFU/L的SS1 Hp菌液每只 0.5 mL进行攻击，隔日1次，共2次。4周后，采用定量Hp培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内Hp感染。用ELISA法检测血清抗Hp IgG、IgG1、IgG2a及唾液和胃黏膜内抗Hp IgA，用SP免疫组织化学法检测胃黏膜内分泌型IgA（sIgA）。结果:①以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率达60%，与以CT为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率（58.33%）相似，显著高于单纯Hp抗原组及其它不含Hp抗原组（P<0.01或P<0.05），同时以CT＋壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的保护率为84.62%、85.71%，其Hp的定植评分显著低于无佐剂组及以CT为佐剂组（P<0.01，P<0.05）。②含佐剂的Hp疫苗所诱导产生的Hp IgG水平显著高于对照组及无佐剂组（P<0.01，P<0.05），而以CT＋壳聚糖为佐剂组所产生的抗Hp IgG水平显著高于仅以 CT或壳聚糖为佐剂组（P<0.05）。③胃黏膜内sIgA及特异性抗Hp IgA水平在壳聚糖为佐剂组与以CT为佐剂组无差别（P>0.05），显著高于无佐剂组，而壳聚糖与CT联合应用组显著高于单以CT为佐剂组（P<0.01，P<0.05）。结论:以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗对Hp感染具有免疫保护作用，并可成功诱导黏膜局部的特异性体液免疫应答，从而发挥免疫防御作用。     

壳聚糖介导增强幽门螺杆菌Lpp20 DNA疫苗黏膜免疫效果的研究

目的 探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法 采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖(CS)纳米粒(NPs),并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究;用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫(滴鼻和口服)小鼠,检测免疫小鼠的细胞和体液免疫水平.结果 裸质粒pcDNA3.1(+)/Lpp20与CS/DNA NPs通过黏膜免疫均能诱导小鼠产生有效的免疫应答.CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组诱导的抗体明显升高,与裸质粒组相比有明显差异(P＜0.05),同时CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数及培养上清中IFN-γ和IL-4含量明显高于裸质粒组、壳聚糖组和PBS组,且滴鼻免疫组高于口服组.结论 壳聚糖纳米粒能增强pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗的黏膜免疫(滴鼻和口服免疫)效果;载Lpp20基因壳聚糖纳米粒滴鼻免疫比口服免疫能诱导更强的细胞和体液免疫应答.

Abstract：

Objective To investigate the immune response of mucosal immunization of new chitosan(CS) nanoparticles coating DNA vaccine. Methods The chitosan nanoparticles containing plasmid DNA encoding H. pylori lipoprotein Lpp20 gene were prepared using a complex coacervation method and then its speciality were analyzed. We then administered the naked plasmid DNA and chitosan-DNA nanoparticles to 6-week-old female BALB/c mice by intranasal or oral mucosal routes to observe the humoral and cellular immune responses. Results Naked plasmid pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 and chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles both induced effective immune response in mice through mucosal vaccination. Specific IgG and sIgA antibodies of chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles groups were higher than that of naked pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 group. The concentration of cytokines IFN-γ and IL-4 in cultural supernatant of T lymphocytes from chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles immunized mice increased greatly than that of control groups. After stimulated by corresponding antigen, the stimulation index of intranasal or oral delivery of chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles group was significantly higher than that of pcDNA3.1( + )/Lpp20 group, CS group and PBS control group. Moreover, systemic and mucosal immune responses in mice induced by intranasal immunization were stronger than that of oral immunization. Conclusion Chitosan nanoparticles enhanced the immune response of pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 DNA vaccine by intranasal or oral administration in BALB/c mice. Compared to oral administration, intranasal delivery of chitosan-pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 DNA nanoparticles could induce stronger cellular and humoral immune responses in BALB/c mice.     

铝佐剂在幽门螺杆菌疫苗中的应用

铝佐剂是到目前为止唯一被批准用于人用疫苗的佐剂,长期普遍用于多种疫苗。最近,在幽门螺杆菌(Helico-bacter pylori,Hp)疫苗的研究中,有一些关于铝佐剂的报道。本文就铝佐剂的组成、制备、免疫机制及在抗幽门螺杆菌疫苗中的研究状况做一综述。     

幽门螺杆菌疫苗免疫机制的研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于人体胃粘膜的重要致病菌,而粘膜疫苗以其有效的保护性免疫成为防治H.pyiori的热点,但对相应的免疫机制的认识目前尚不明确.故本文对H.pyiori疫苗的保护性免疫机制中的抗原递呈机制,抗体的作用以及TH细胞反应的作用等研究进展做一概要介绍.     

重组幽门螺杆菌疫苗免疫保护作用与免疫后胃炎

目的：研究以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)疫苗的免疫保护机制。方法：将表达不同Hp抗原的减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)分别免疫小鼠，免疫4周后以Hp攻击；在攻击前及攻击后5周分批处死小鼠，比较各组小鼠Hp定植密度及各项免疫指标的变化。结果：(1)和NS(Normal salin，NS)对照组相比各免疫组的Hp定植密度显著下降。(2)和NS组相比攻击前后各免疫组血清IgG2a和胃黏膜Th1型细胞因子表达显著升高。(3)和NS组相比攻击后免疫组鼠胃黏膜出现明显的炎症反应。结论：以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建的重组幽门螺杆菌疫苗在小鼠体内诱导出以Th1反应为主并伴随免疫后胃炎的保护性免疫应答。     

Th细胞在幽门螺杆菌疫苗诱导肠粘膜免疫中的调节作用

幽门螺杆菌 (helicobacter pylori,Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌 ,并且与胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的发生发展密切相关 [1 ] 。采用疫苗预防、治疗 Hp感染 ,已成为近年来的研究热点 [1 ] 。本研究采用 Hp全菌超声上清和佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素口服免疫 BAL B/ c小鼠 ,从分子水平分析肠粘膜免疫主要诱导部位派伊尔小结 (PP)的 Th1、Th2细胞在粘膜免疫应答中的调节作用 ,为 Hp口服疫苗研制提供免疫学依据。1　材料与方法1.1　实验动物　雌性 BAL B/ c小鼠 (本校实验动物中心提供 ) ,6～ 8周龄 ,18～ 2 5 g,2 0只随机…     

幽门螺杆菌微球疫苗免疫诱导的免疫应答

目的通过对幽门螺杆菌微球免疫后Balbc小鼠血清IgG、IgA、胃肠sIgA的检测及脾脏IL4、IFNγ的mRNA表达水平、IgGASC、IgAASC数量的比较观察,探求疫苗的免疫保护机理。方法取Balbc小鼠口服免疫疫苗,剂量为150μg/(只·次),免疫时间为0、14、30d。2周后取血清及胃肠洗液进行抗体检测,同时取脾脏检测细胞因子mRNA表达水平及ELISPOT检测抗体分泌细胞数量变化。结果免疫后小鼠以上检测指标与对照组比较均有不同程度的升高。结论微球疫苗所诱发的免疫保护是细胞免疫、体液免疫两者共同作用的结果。     

OipA DNA疫苗抗螺旋形和球形幽门螺杆菌免疫保护作用及其机制

目的探讨pcDNA3.1-oipA DNA疫苗在抗螺旋形与球形幽门螺杆菌（Hp）感染中的作用及其机制.方法抽提并纯化可表达OipA蛋白的重组质粒pcDNA3.1-oipA,以金粉包裹后,用基因枪接种BALB/c小鼠,5 μg/只,接种2次,以pcDNA3.1（空载组）作对照.对免疫小鼠进行：（1）免疫保护实验：于末次免疫后8周,分别给予螺旋形及球形Hp SS1攻击4次,于末次攻击4周后取胃组织做细菌学（组织尿素酶试验、细菌培养）及病理学检测.（2）小鼠免疫指标检测：分别于末次免疫后2、8、12周采集小鼠血清,用ELISA法检测其抗Hp OipA IgA、IgG、IgG1抗体.于末次免疫后12周,取脾细胞,用FLISA法检测IFN-γ、IL-2的含量;用流式细胞术检测CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值.结果以螺旋形及球形Hp攻击的免疫小鼠,快速尿素酶实验阳性率分别为20%和10%;细菌培养阳性率分别为60%和50%,与空载组比较P＜0.05.空载组小鼠胃黏膜均出现轻度或重度糜烂,而以螺旋形Hp攻击的实验组小鼠50%胃黏膜正常,以球形Hp攻击的实验组小鼠60%胃黏膜正常,与空载组比较P＜0.05.小鼠免疫指标检测结果：免疫后8周,产生了抗OipA的特异性IgA、IgG、IgG1抗体,抗体滴度比对照组高2倍以上;脾细胞中CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值升高;脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-2的含量明显高于对照组（P＜0.05）.结论 pcDNA3.1-oipA DNA疫苗能有效诱导免疫小鼠产生体液与细胞免疫并使小鼠兼具一定的抗螺旋形及球形Hp感染的能力.     

幽门螺杆菌相关抗原及宿主免疫应答的研究进展

幽门螺杆菌与多种胃肠道疾病诸如慢性胃炎,胃肠溃疡,胃腺瘤及胃癌等密切相关的结论已得到证实,预防和治疗幽门螺杆菌感染是控制其广泛传播的有效途径,此项工作虽早已开始,但至今未找到可行的方案.近来对幽门螺杆菌相关毒素的研究越来越多,这可作为研究幽门螺杆菌菌苗的重要依据;幽门螺杆菌诱发的宿主免疫应答以TH1反应为主,幽门螺杆菌感染者可出现系统和局部的抗体反应,这些抗体反应对机体不具保护作用且自身抗体对宿主上皮细胞还可能带来不良影响,阐明宿主免疫应答的机制对预防和治疗幽门螺杆菌感染具特殊意义.因此,本文主要介绍了脲素酶、空泡细胞毒素、cag相关基因蛋白,中性粒细胞蛋白等几种毒素及宿主免疫应答的研究现状,并对幽门螺杆菌的研究前景进行综述.     

壳聚糖对幽门螺杆菌形态及超微结构的影响

目的　从细菌形态和超微结构探讨壳聚糖抗幽门螺杆菌 (Hp)的作用机理。方法　将Hp与壳聚糖作用 2 4h后 ,在透射和扫描电镜下观察Hp的细菌形态和超微结构变化。结果　 (1)透射电镜结果 :Hp形态多样 ,以球形体为主 ,并可见V形、U形和不规则形 ;Hp菌胞壁变薄不完整 ,有的菌体细胞壁部分或全部脱落消失 ,细菌轮廓模糊 ,结构不清 ,且发生不同程度的凹陷变形 ,甚至穿孔和破碎 ;胞浆内容物稀疏 ,空隙明显扩大 ;细菌内部结构消失或分布异常 ,胞质不均匀或密度下降 ,出现高电子密度颗粒。 (2 )扫描电镜结果 :Hp形态多样 ,以球形体为主 ,并可见U形和不规则形 ;细菌表面广泛改变 ,黏附有可折射物质 ,外观呈毛刺状。结论　壳聚糖可能通过破坏Hp外膜的结构、功能和通透性 ,使细菌内容物渗出 ,细菌破裂 ,并从破损的细胞外膜进入Hp内 ,与胞质作用 ,扰乱其代谢。这二方面机制发挥抗Hp作用     

卵黄抗体液对幽门螺杆菌感染小鼠胃粘膜损伤的治疗作用

目的观察卵黄抗体液对幽门螺杆菌(Hp)感染小鼠胃粘膜损伤的治疗作用。方法给BABL/c小鼠采用灌胃法定植Hp,建立BABL/c小鼠感染胃炎动物模型。胃管灌胃前小鼠断食、断水12h,给予2%NaHCO3溶液0.2ml灌胃,1h后再给予Hp新鲜混悬菌液(109CFU)0.4ml灌胃,1h后恢复正常饮食,每两天重复一次,连续六次,造模成功后卵黄抗体治疗组分别灌服高、中、低剂量卵黄抗体液(0.6ml/0.4ml/0.2ml)1次/d,连续13d,正常对照组和胃炎模型组每只灌服生理盐水0.4ml1次/d,连续13d。距最后一次灌胃后8周,颈椎脱臼法处死小鼠,胃粘膜直接涂片、快速尿素酶试验及胃粘膜组织细菌培养检查小鼠Hp根除情况,并对胃窦部粘膜进行病理组织学检查。结果卵黄抗体液组分高、中、低剂量组的Hp根除率分别为80%、60%、40%,均明显高于模型组(P<0.05),同时胃窦部粘膜炎症较模型组均有不同程度的改善,组织切片Giemsa染色后卵黄抗体液组的Hp定植明显减少尤以高剂量组明显。结论卵黄抗体液组分具有较好的抗Hp感染和抗胃粘膜损伤作用并对胃炎有一定的治疗作用。     

Effects of a Th1- versus a Th2-biased immune response in protection against Helicobacter pylori challenge in mice

The roles that T helper type 1 (Th1) and T helper type 2 (Th2) Helicobacter pylori-specific immune responses play in protection from H. pylori challenge are poorly understood. It is expected that Th2 immune responses are required for protection against extracellular bacteria, such as H. pylori. However, recent studies have suggested that Th1 immunity is required for protection. The mechanisms by which this might occur are unknown. Our goal in this study was to more clearly define the effects of a Th1- versus a Th2-promoting H. pylori vaccine on immunity and protection. Therefore, we tested a Th1 vaccine consisting of an H. pylori sonicate and CpG oligonucleotides (CpG) and a Th2 vaccine consisting of a lipopolysaccharide (LPS)-depleted H. pylori sonicate combined with cholera toxin (CT). We demonstrate that although the Th2-promoting vaccine induced stronger systemic and local immune responses, only the Th1-promoting vaccine was protective.     

Effect of antioxidants on the immune response of Helicobacter pylori

Antioxidants are substances capable of inhibiting oxidation. In chronic diseases, inflammatory response cells produce oxygen free radicals. Oxygen free radicals cause DNA damage, and this may lead to gene modifications that might be carcinogenic. Chronic Helicobacter pylori infection causes the production of DNA-damaging free radicals. In recent years, various groups have studied the effects of antioxidants, especially on H. pylori -associated gastric cancer. In most of the studies, it has been shown that H. pylori infection does affect the level of antioxidants measured in the gastric juice, but there are also controversial results. Recent experimental studies, both in vivo and in vitro, have shown that vitamin C and astaxanthin, a carotenoid, are not only free radical scavengers but also show antimicrobial activity against H. pylori. It has been shown that astaxanthin changes the immune response to H. pylori by shifting the Th1 response towards a Th2 T-cell response. Very few experimental studies support the epidemiologic studies, and further studies are needed to describe the effect and the mechanism of antioxidants in the H. pylori immune response.     

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB）的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过13服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA．ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E．coliB121（DE3）,进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26／60Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westemblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb／c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25％,Tris-Tficine初步测定目的蛋白的肘,约59000,纯化后纯度大于90％。Westemblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IsA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sigA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。