通窍活血汤含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠BMECs的保护作用

目的:探讨通窍活血汤含药脑脊液对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用及潜在机制。方法:通过酶消化法提取原代BMECs,并将细胞随机分为6组,分别为正常组,OGD/R组,通窍活血汤(TQHXT)组(20%),尼莫地平(NMDP)组(10μmol·L~(-1)),卡博替尼(BMS)组(1μmol·L~(-1))和合用药组。除正常组外,其余各组细胞在氧糖剥夺2 h后迅速复糖复氧24 h进行OGD/R造模并分组给药。采用细胞免疫荧光染色法鉴定BMECs,观察OGD/R损伤大鼠BMECs的形态学和超微结构改变并检测细胞跨膜电阻(TEER)值变化。用试剂盒检测细胞内一氧化氮(NO)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧(ROS)荧光强度和组织型纤溶酶原激活因子(tPA)含量。采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度及细胞凋亡,观察血管新生标记因子CD34的表达,用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中紧密连接蛋白(ZO-1),血管内皮生长因子(VEGF),黏着斑激酶(FAK)和桩蛋白(Paxillin)蛋白的表达情况。结果:与正常组比较,OGD/R组细胞皱缩、变圆,细胞TEER值和细胞中ZO-1蛋白表达显著降低,细胞中NO,LDH及ROS水平显著升高,tPA含量显著降低,细胞中钙离子浓度和细胞凋亡显著增加,细胞中CD34有所表达,VEGF,FAK和Paxillin蛋白表达显著升高(P0. 01);与OGD/R组比较,TQHXT组细胞损伤明显改善,细胞TEER值和细胞中ZO-1蛋白表达显著升高,细胞中NO,LDH及ROS含量显著降低,tPA含量显著升高,细胞中钙离子浓度和细胞凋亡显著减少,细胞中CD34表达增加,VEGF,FAK和Paxillin蛋白表达显著升高(P0. 05,P0. 01)。结论:通窍活血汤含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠BMECs具有保护作用,该保护作用可能是通过VEGF/VEGF受体2(R2)/FAK/Paxillin信号通路促进血管生成来发挥作用。     

心肌尔康对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的作用

目的:研究心肌尔康(XJEK)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的作用,并探讨相关的作用机制。方法:体外培养HUVECs细胞,随机分为7组,分别为空白组,AngⅡ(1×10~(-5)mol·L~(-1))组,AngⅡ(1×10~(-5)mol·L~(-1))+心肌尔康不同质量浓度组(0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 g·L~(-1)),噻唑蓝(MTT)比色法检测HUVECs的活性;Griess法测定一氧化氮(NO)含量;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)的水平;钙成像仪测定细胞胞浆内游离钙离子(Ca~(2+))浓度;比色法及TBA法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内皮型一氧化氮合酶(e NOS)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,AngⅡ组内皮细胞活力,NO释放,e NOS蛋白表达及SOD活力明显降低,MDA,ROS含量和内皮细胞胞浆内Ca~(2+)浓度明显升高(P0.05,P0.01);与AngⅡ组比较,心肌尔康可剂量依赖性提高内皮细胞活力,促进NO释放、增加e NOS蛋白的表达;升高SOD活力,抑制MDA,ROS含量和内皮细胞胞浆内Ca~(2+)浓度的升高,各指标差异均具有显著性(P0.05,P0.01)。结论:心肌尔康对AngⅡ诱导的内皮损伤具有明显的保护作用,其可能机制为抑制细胞内Ca~(2+)超载和降低氧化应激水平。     

淫羊藿总黄酮对谷氨酸和咖啡因损伤PC12细胞的保护作用

目的探讨淫羊藿总黄酮(TFE)对谷氨酸和咖啡因损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)的保护作用及相关机制。方法制备谷氨酸和咖啡因诱导的PC12细胞损伤模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率、荧光染料Fura-2/AM法测定细胞内Ca~(2+)、比色法测定细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内羟自由基(·OH)和三磷酸腺苷(ATP)酶活性来观察TFE对损伤细胞的保护作用。结果 TFE能剂量依赖性地提高细胞存活率,减轻细胞内Ca~(2+)超载,降低细胞外LDH活性和细胞内·OH活性,恢复细胞内ATP酶活性。结论 TFE对谷氨酸和咖啡因致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制可能与抑制细胞内Ca~(2+)超载、抗氧化和改善能量代谢有关。     

活血温通方对缺氧心肌细胞氧化应激和凋亡的影响

[目的]观察活血温通方对缺氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。[方法]采用H9c2心肌细胞进行缺氧无血清刺激,同时加入活血温通方含药血清和空白血清处理4 h后,检测细胞活力、Caspase 3和Caspase 8活性、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量,并进行二氢乙啶(DHE)染色观察活性氧(ROS)变化,以及Hoechst染色观察细胞凋亡情况,对比分析各组之间差异。[结果]与对照组比较,缺氧组H9c2心肌细胞活力、SOD和CAT活性显著下降(P0.01),Caspase 3和Caspase 8活性、MDA含量明显升高(P0.01),同时累积的ROS含量和细胞凋亡数量增多(P0.01)。活血温通方含药血清能提升细胞活力、增加SOD、CAT活性(P0.01),明显降低MDA水平、Caspase 3和Caspase 8活性(P0.01),同时减少ROS累积,抑制心肌细胞凋亡(P0.01)。[结论]通过抑制细胞凋亡、减轻氧化应激,活血温通方一定程度上可以保护心肌细胞免受缺氧损伤。     

人参-牡丹皮功效部位含药血清对H_2O_2诱导损伤的HUVEC的保护作用

探讨人参-牡丹皮功效部位含药血清对过氧化氢(H_2O_2)诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响。实验采用H_2O_2诱导损伤HUVEC,分为6组[空白组、模型组、人参总皂苷(TGG)组、丹皮总苷(TGM)组、丹皮酚(P)组、TGG+TGM+P组],各组药物与H_2O_2共培养24 h后,微量酶标法检测细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶的活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡率及细胞内Ca~(2+)浓度、活性氧(ROS)及线粒体膜电位(JC-1)水平;Western blot法检测线粒体凋亡通路相关蛋白Bax, Bcl-2,cytochrome C,caspase-3,caspase-9的表达情况。结果显示H_2O_2对HUVEC有明显的损伤作用,使细胞SDH和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶的活性显著降低(P0.01),细胞凋亡+坏死率、JC-1下降率、ROS升高率和Ca~(2+)浓度升高率显著升高(P0.01);人参-牡丹皮功效部位含药血清可不同程度地升高细胞内SDH和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶活性(P0.05或P0.01),降低细胞凋亡+坏死率、JC-1下降率、ROS升高率和Ca~(2+)浓度升高率(P0.05或P0.01);同时下调线粒体凋亡通路相关蛋白Bax, caspase-3,caspase-9,cytochrome C表达水平,上调Bcl-2蛋白表达水平。结果表明,人参-牡丹皮功效部位含药血清对ROS所致血管内皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与改善线粒体功能,抑制线粒体凋亡通路被激活有关。     

通窍活血汤含药血清对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用

目的:从细胞水平研究通窍活血汤含药血清(TQHXD)对谷氨酸(Glu)损伤的PC12细胞的保护作用,为该方剂的临床应用提供依据。方法:SD大鼠灌胃给予通窍活血汤提取液,每日2次,每次4 g.kg-1,连续5 d,制备通窍活血汤含药血清。采用PC12细胞和终浓度为12.5 mmol.L-1的谷氨酸共培养,造成神经细胞损伤模型。光镜观察5%,10%,20%的TQHXD对损伤PC12细胞形态改变的影响;台盼兰染色法、AO/EB染色法及LDH法观察TQHXD对损伤的细胞膜通透性的变化影响;MTT法检测TQHXD对PC12细胞增殖及活性的影响及对培养上清液中NO浓度的影响。结果:倒置显微镜下可见,正常组细胞胞体较损伤组略大,呈强折光性,细胞数量多,突起长。模型组细胞数量显著减少,折光性明显减弱,细胞突起减少、缩短。TQHXD和PC12细胞共培养24 h后,活细胞数明显增加,细胞折光性增加,损伤细胞形态接近于正常细胞;台盼兰染色后,TQHXD组活细胞比率明显上升,AO/EB染色后被EB染色的数量较少。MTT法检测结果显示,与模型组比较,各浓度TQHXD组的吸光度A均升高且有显著性差异。各浓度的TQHXD组细胞培养上清中LDH,NO含量相对模型组明显减少,两者有显著性差异。结论:TQHXD对Glu损伤的PC12细胞有明显的保护作用。     

醋炙降低芫花二氯甲烷部位对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6毒性的研究

该实验以大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象,比较醋炙前后芫花二氯甲烷部位对IEC-6细胞的毒性差异,初步探讨芫花醋炙减毒的机制。通过MTT法筛选芫花各极性部位对于IEC-6细胞毒性,比较醋炙前后芫花毒性部位对IEC-6细胞活性的影响;通过测定IEC-6细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、Na~+-K~+-ATP酶,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶等酶的活力和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量评价IEC-6细胞氧化损伤程度;使用流式细胞术检测IEC-6细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。结果表明芫花二氯甲烷部位为致IEC-6细胞的毒性部位,醋炙后二氯甲烷部位毒性显著降低(P0.01)。与空白组相比,芫花二氯甲烷部位可显著降低IEC-6细胞中Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶、SOD活力(P0.01),显著提高细胞上清液LDH,MDA含量,显著降低细胞中GSH的含量(P0.01)。同时,芫花二氯甲烷部位能显著提高IEC-6细胞的早期与晚期凋亡率,显著降低G1期细胞百分比,增加S与M期细胞百分比(P0.01)。醋炙后,与相应芫花生品二氯甲烷组相比,醋芫花二氯甲烷组可显著提高IEC-6细胞内Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶、SOD活力(P0.01),显著降低细胞中LDH,MDA含量(P0.01),显著提高细胞中GSH含量(P0.01)。显著降低IEC-6细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率(P0.01),显著增加G1期细胞百分比,减少S与M期细胞百分比(P0.01)。提示醋炙可降低芫花二氯甲烷部位致IEC-6细胞的毒性,其可能机制为提高细胞中抗氧化酶的活性与细胞膜的通透性,降低氧化损伤而实现。     

葛根总黄酮对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制

目的:研究葛根总黄酮对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激损伤的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:以HUVECs为研究对象,实验分为空白组、模型组、阳性药组(10μmol·L~(-1)依达拉奉)和葛根总黄酮10,20,40,80,160 mg·L~(-1)组;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测葛根总黄酮对HUVECs的保护作用,采用分光光度法测定细胞培养上清液中细胞内超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)及NO含量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清液中内皮素-1(ET-1)含量;采用二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)法检测活性氧(ROS)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内皮型一氧化氮合酶(e NOS)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著降低(P0.01),SOD活性,NO水平和e NOS蛋白表达显著降低(P0.01),MDA,ET-1水平,细胞ROS水平和VCAM-1蛋白表达显著升高(P0.01);与模型组比较,葛根总黄酮(40,80,160 mg·L~(-1))可以显著提高氧化应激损伤的HUVECs的存活率(P0.05,P0.01),葛根总黄酮(20,40,80 mg·L~(-1))可显著增加SOD活性,升高NO水平,显著降低MDA,ET-1水平,显著降低细胞ROS水平,显著升高e NOS,降低VCAM-1的表达(P0.05,P0.01)。结论:葛根总黄酮对H2O2诱导HUVECs氧化应激损伤有保护作用,其作用机制可能与调节SOD,MDA,ET-1,NO氧化应激相关因子,调控内皮细胞功能相关蛋白e NOS,VCAM-1的表达有关。     

松花粉对H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨松花粉对过氧化氢(H_2O_2)诱导人肝癌HepG2细胞应激性氧化损伤的保护作用。方法:将HepG2细胞分为正常组,H_2O_2模型组和样品干预组。样品干预组用不同浓度的松花粉预处理HepG2细胞12 h,H_2O_2模型组和样品干预组用400μmol·L~(-1)过氧化氢氧化损伤细胞2 h,产生氧化应激损伤。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测HepG2细胞活力;微板法检测细胞内活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测抗氧化通路中关键基因核因子E2相关因子2(Nrf2),Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1),谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达水平,以评价松花粉对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用。结果:MTT结果显示,与正常组比较,松花粉(80,40,20,10,5 mg·L~(-1))对HepG2细胞没有毒性;H_2O_2模型组中ROS,LDH及MDA的水平显著升高(P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著降低(P0.01)。与H_2O_2模型组比较,松花粉干预组中ROS,LDH及MDA的水平显著降低(P0.05,P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著升高(P0.05,P0.01)。Western blot结果显示,松花粉显著上调Nrf2,HO-1和GCL的蛋白表达,并下调Keap1的蛋白表达。结论:质量浓度5~20 mg·L~(-1)松花粉可有效保护400μmol·L~(-1)H_2O_2对HepG2细胞应激性氧化损伤。其机制可能与调节SOD,GSH-Px活性,ROS,LDH,MDA水平有关,同时与调控抗氧化通路中关键基因Nrf2,Keap 1,HO-1,GCL蛋白的表达水平有关。     

红花注射液对痛经模型小鼠血清NO、Ca2+、MDA、SOD 的影响

目的:探讨红花注射液对痛经模型小鼠血清一氧化氮(NO)、Ca~(2+)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法:将ICR雌性未孕小鼠24只,随机分为空白组、模型组、红花组3组。模型组和红花组运用雌激素联合缩宫素法诱发原发性痛经模型。空白组及模型组给予生理盐水,红花组给予红花注射液,连续7 d。测定小鼠血清NO、Ca~(2+)、MDA、SOD含量,子宫称重并计算子宫系数,制备子宫切片观察腺体增生、炎细胞浸润以及上皮化生情况。结果:与空白组比较,模型组小鼠扭体次数、子宫系数、血清Ca~(2+)、MDA水平增高(P0.01,P0.05),血清NO含量下降(P0.05),SOD水平降低但差异无统计学意义。与模型组比较,红花组小鼠扭体次数、子宫系数、血清Ca~(2+)、MDA水平降低(P0.01,P0.05),血清NO含量增高(P0.05),SOD水平升高但差异无统计学意义。结论:红花注射液对小鼠痛经有缓解作用,其作用机制可能与增加血液中NO,降低MDA、Ca~(2+)含量有关。