大鼠原代神经元的培养及操作技巧

目的:建立一种实用体外原代培养新生大鼠皮层神经元的方法.方法:取24h内的SD乳鼠两侧大脑皮层,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.利用免疫细胞化学进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长;经神经元特异性鉴定,培养的神经元纯度可达90%以上.结论:该技术是一种可靠、稳定的获得神经元的方法,可以用于实验.     

NO供体硝普纳损伤脊髓背根神经元模型的建立

目的在乳鼠背根神经节神经元原代纯化培养方法的基础上,采用硝普钠(SNP)制备背根神经节神经元损伤模型。方法取乳鼠背根神经节,加入5-氟-2'-脱氧尿苷(5-FUDR)以纯化细胞,MEM-F12培养基培养,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定神经元。神经元培养至第八天分别加入不同浓度SNP(500,50,5μmol·L-1)制备背根神经节神经元损伤模型,用台盼蓝染色进行细胞计数,MTT法测定培养神经元活力。结果培养的脊髓背根神经节神经元生长状态正常,纯化培养纯度高于90%,可存活两周以上。培养的背根神经节神经元加入SNP作用后,随着浓度增加,神经元死亡率逐渐升高。结论采用SNP制备的脊髓背根神经节神经元损伤模型稳定、可靠,可以作为相关实验研究的理想的体外实验模型。     

新生大鼠原代皮质神经元细胞差数贴壁培养法的优化

神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段,但要获得纯度较高,生长状态较好的神经元并非易事.神经元属于终末分化细胞,给培养带来一定难度,传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养,因其细胞分化程度低利于存活,但胎鼠取材需处死孕鼠,费用较高且操作繁琐,本实验利用细胞的贴壁时间不同,筛选了一种简便、经济、可行的大鼠原代神经元差数贴壁培养方法[1～4].     

粉防己碱对喹啉酸致海马神经元损伤的保护作用

目的研究粉防己碱(Tet)对喹啉酸(QA)诱导原代培养乳鼠海马神经元兴奋毒损伤的保护作用。方法乳鼠海马神经元原代培养后用QA诱导损伤,MTT法测定细胞活力,同时测定培养上清中LDH活性,神经元病理染色后进行形态学观察。结果Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)能明显提高QA损伤后原代培养乳鼠海马神经元的细胞活力,降低其上清液中LDH活性,与模型组相比,差异均有显著性(P<0.01),并明显改善神经元病理损伤。结论Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)对QA所致的原代培养乳鼠海马神经元损伤有明显保护作用。     

皮质神经元B27原代培养及MAP2鉴定

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)鉴定培养神经元的纯度。结果神经元细胞存活率高,在体外培养条件下细胞状态良好,生长旺盛。培养第4天,可见多数细胞长出1、2个突起并交织成网。培养第8天细胞胞体较大,能形成典型的神经细胞网络。培养第10天,鉴定神经元纯度质量分数达90%以上。结论该方法简便可行,是体外培养神经元较理想的方法。     

胎鼠海马神经元的无血清原代培养方法与形态学观察

目的建立SD大鼠胎鼠海马神经元的分离、培养方法，观察体外培养过程中神经元的形态学变化，为进行海马神经元的体外研究提供技术支持。方法分离18天胎龄的SD大鼠胎鼠的海马区，经机械吹打，台盼蓝计数后，采用无血清培养基接种于24孔板。每天在显微镜下进行神经元的形态观察；第7天用免疫组化染色法检测微管相关蛋白2（MAP2）的表达，进行神经元鉴定及纯度计算。结果机械分离18天胎龄的SD大鼠胎鼠海马得到细胞，经台盼蓝染色，细胞存活率在98％以上。神经元在体外生长良好，培养第7．10天时胞体最为丰满，神经元突起间互相接触形成致密的网络，28天时细胞数量明显减少，可见大量变性的神经元细胞碎片。MAP2鉴定结果显示，培养7天的海马神经元纯度为92．8％。结论此培养方法获得的海马神经元纯度高、体外存活时间长，具有简便易行，结果稳定的优点，可作为神经元体外培养的良好模型。     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法.方法:体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法鉴定神经元.结果:用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达70%,生长状态较佳.结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法.     

大鼠脊髓神经元的原代无血清培养及鉴定

目的建立Wistar大鼠脊髓神经元的分离、无血清培养方法,为进行脊髓神经元的体外研究提供技术支持。方法分离14-17 d胎龄Wistar大鼠胎鼠的脊髓,经机械吹打,细胞计数后,接种于24孔板。每天在显微镜下进行神经元的形态观察。第7天用SABC免疫组化染色法检测神经元特异性烯醇化酶的表达。结果采用ITS无血清培养基,神经元生长良好,第7天神经元纯度达95%以上。结论机械分离无血清培养神经元的方法具有简便可行,结果稳定的优点,可作为神经元体外培养的良好模型,值得推广应用。     

果糖二磷酸锌对体外培养新生小鼠大脑皮层神经细胞生长发育的影响

目的 :研究不同剂量果糖二磷酸锌 (ZnFDP)对体外培养新生小鼠大脑皮层神经细胞的生长发育的影响。方法 :采用体外培养的新生小鼠大脑皮层神经细胞 ,在血清培养液中加入低、中、高3种剂量ZnFDP ,使之终浓度分别为2 5、12 5、125μg/ml,通过细胞形态学观察、神经元突起和胞体生长状况的定量比较、不同培养期细胞存活数和培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)渗漏量的测定来考察ZnFDP对大脑皮层神经细胞生长发育的影响。结果 :培养48h后与对照组比较 ,中剂量ZnFDP组大脑皮层神经元的突起数目增多 ,突起长度增加 ,胞体长径没有显著性变化 ;低剂量ZnFDP组与对照组比较 ,各项指标没有显著性差别 ;高剂量ZnFDP组则明显抑制神经细胞分化。培养3、7、10d ,中剂量ZnFDP组细胞存活数明显高于对照组 ;培养7、10d ,中剂量ZnFDP组LDH渗漏量明显低于对照组。结论 :适量的ZnFDP能促进大脑皮层神经细胞的生长发育。     

Chronotropic effect of tyramine on rat heart cells cultured with sympathetic neurons

Dissociated newborn rat superior cervical ganglion neurons in culture without exogenous nerve growth factor survive and extend processes on a monolayer of rat heart ventricular cells. An increase in the contraction rate of the heart cells was observed in 83% of the co-cultures treated with 5 × 10^?6 M. tyramine. No increase was seen in heart cell cultures without neurons. These results are consisted with the assumed mode of action of tyramin— the release of catecholamines from nerve terminals - and suggest that functional interaction can occur in culture between sympathetic neurons and heart vettricular cells     

含去痴灵挥发油的大鼠血清对体外培养新生小鼠皮层神经元的营养作用*

目的:研究含去痴灵挥发油的大鼠血清对体外培养新生小鼠皮层神经元的营养作用。方法:采用血清药理学方法,制备含去痴灵挥发油的大鼠血清。体外培养新生小鼠皮层神经元,在无血清培养液中加入含去痴灵挥发油的大鼠血清,使培养基中含药血清的最终体积分数分别为0.1%,0.5%和2.5%,设立空白血清对照组和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF,终浓度为20 ng.mL-1)阳性对照组。观察培养48 h细胞的形态学改变,定量比较神经元突起数目和长度;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测培养d 4和d 8神经元存活数;并用RT-PCR测定培养d 4时神经元细胞的微管相关蛋白2(MAP2)的mRNA含量。结果:0.5%和2.5%的含去痴灵挥发油的大鼠血清均能使神经元突起数目和长度增加、不同培养期细胞存活数增加、MAP2基因表达量增加。结论:含去痴灵挥发油的大鼠血清对新生小鼠皮层神经元具有营养作用。     

新生小鼠神经干细胞体外培养、分化及鉴定

目的 简化神经干细胞原代培养的取材及步骤,明确体外定向诱导分化条件,为进一步神经干细胞移植相关实验提供基础条件。方法 新生24 h昆明种小鼠无菌条件下冰上取大脑组织,经机械分离加胰酶消化吹打后,加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和B27的DMEM/F12培养基中培养;加入不同浓度胎牛血清诱导其分化,应用免疫荧光技术行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2染色,对培养细胞鉴定。结果 新生小鼠提取神经干细胞可形成神经球,并稳定增殖传代,经诱导可定向分化为神经元及星形胶质细胞。结论 新生小鼠较胎鼠取材简单,可培养高质量神经干细胞,血清浓度同向星型胶质细胞方向的分化概率呈正相关。     

观察原代培养新生鼠脊髓神经元中溶酶体的变化与影响

目的探讨培养脊髓神经元中溶酶体的影响因素。方法原代分离细胞培养大鼠脊髓神经元,培养细胞荧光染色,酶组织化学染色。结果培养的脊髓神经元随培养天数的增加,神经元的突起延长,且突起间逐渐相互连接。神经元中溶酶体经酸性磷酸酶(ACPase)染色后可见散在分布于神经元的胞体及突起内,细胞核ACPase反应阴性。经吞噬荧光黄(luciferyellow,LY)证实,培养的脊髓神经元在施加佛波醇肉豆蔻酸乙酯(PMA)后可见脊髓神经元中胞体及突起均有荧光,且荧光呈网络状分布,胞核无荧光。说明PMA有利于胞体及突起的生长。结论培养脊髓神经元中,溶酶体存在于胞体及突起中,PMA影响脊髓神经元的形态以及溶酶体在神经元的分布     

Optimisation of culture conditions for differentiation of C17.2 neural stem cells to be used for in vitro toxicity tests

Here we present a multipotent neuronal progenitor cell line for toxicity testing as an alternative to primary cultures of mixed cell types from brain tissue. The v-myc immortalised C17.2 cell line, originally cloned from mouse cerebellar neural stem cells, were maintained as monolayer in cell culture dishes in DMEM supplemented with fetal calf serum, horse serum and antibiotics. Different media and exposure scenarios were used to induce differentiation. The optimal condition which generated mixed cultures of neurons and astrocytes included serum-free DMEM:F12 medium with N2 supplements, brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor. The medium was changed every 3rd or 4th day to fresh N2 medium with supplements. After 7 days, the culture contained two different morphological cell types, assumed to be neurons and glia cells. The presence of astrocytes and neurons in the culture was confirmed by RT-PCR and Western blot analyses, indicating increased mRNA and protein levels of the specific biomarkers glial fibrillary acidic protein (GFAP) and βIII-tubulin, respectively. Concomitantly, the expression of the neural progenitor cell marker nestin was down-regulated.     

Sensitivity of several cell systems to acrylamide

Chick spinal ganglia, chick muscle cells combined with mouse spinal cord explants, C1300 neuroblastoma cells, Chinese hamster ovary cells and newborn rat cerebral cells were exposed to various concentrations of acrylamide in culture. Four morphological and 1 electrophysiological parameters were applied in order to score toxic effects. It appeared that the neurite formation of rat cerebral neurons was the most sensitive criterion showing an effect at 10^?7 M acrylamide.     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。