蚊虫携带HBV模型的PCR研究

利用ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性血清喂饲中华按蚊，淡色库蚊及白纹伊蚊，分别在吸血后０、２、４、６、１２、２４和４８ｈ将蚊制成匀浆，用经典和粗提法提取ＨＢＶ－ＤＮＡ模板。经聚合酶链反应后，电分析扩增产物：结果；３种蚊虫各时点匀浆的扩增说物中的ＨＢＶ－ＤＮＡ均为阴性。     

乙肝病毒PCR产物的鉴定及单项抗HBc阳性血清的HBV基因扩增

本文报道ＨＢＶ基因扩增产物的限制性酶切分析和寡核苷酸探针杂交鉴定、应用血清ＨＢＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物制备基因探针和单项抗ＨＢｃ阳性血清的ＨＢＶ基因扩增。ＰＣＲ用ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ的Ｃ基因区共有序列为内外两对引物分单次或套式扩增，产物为６６ａｂｐ或４２８ｂｐ，两者序列中段共含－ＢｇＩⅡ酶切点并与一寡核苷酸探针同源。４２８ｂｐ产物被用以缺口平移标记３２Ｐ探针作斑点和转印杂交检测。结合分子杂交的ＰＣＲ结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２例无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，证实病毒低度复制和传染性。     

胃癌组织中的HBV-DNA检测

探讨乙型肝炎病毒感染在胃癌中的意义。方法：采用基因扩增检测６０例胃癌中的ＨＢＶ－ＤＮＡ存在的情况。结果：６０例胃癌中２例可见ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性,阳性率３．３％。结论ＨＢＶ感染可能在某些胃癌中起一定作用。     

2.2.15细胞中HBV DNA前C和C区PCR扩增及其产物测序

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其扩增产物的直接测序技术对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ和Ｃ区进行测序。结果表明，根据ａｙｗ亚型ＨＢＶ基因设计的引物能够扩增２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ扩增产物位于２２１－２９８碱基对之间，而对ａｄｒ亚型ＨＢＶＤＮＡ无扩增作用，说明ＰＣＲ扩增是特异性的，所测到的１３２个碱基序列与ａｗｙ１亚型ＨＢＶＤＮＡ完全符合，提示２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ属ａ     

PCR—谱酶法检测小儿肝炎综合征人疱疹解毒DNA的研究

为探讨婴儿肝炎综合征（ＮＨＳ）与疱疹病毒（ＨＳＶ）感染的关系。在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对引物，能对ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－Ⅱ、ＥＢＶ和ＣＭＶ四种疱疹病毒ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶ＢａｍＨⅠ或ＳｍａⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述四种病毒的ＰＣＲ－酶谱法。灵敏度可测到１ｆｇＤＮＡ，且该引物仅对四种疱疹病毒扩增。用建立的ＰＣＲ－酶谱法检测３０例     

EB病毒3种全基因的扩增,克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、甙激酶及ＨＢＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ＰＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为围论的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳 行为粗筛，再双酶切。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸     

以二氧化硅快速提取HBV－DNA用于双阶变温PCR检测

以异硫氰酸胍裂解血清释放核酸使被二氧化硅吸附，经乙醇洗涤后用水悬浮，上清即含纯化ＤＮＡ。结合双阶变温ＰＣＲ建立一种简单快速的血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法。该法只需检测１０ｕｌ血清，完成提取和扩增只要３ｈ．操作很易掌握。用之检测５６例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ＋的血清、４２例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ－的血清和５４例ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ的血清，结果ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率分别为８６％、５７％和１３％。应用表明这是一种简捷有效的核酸纯化和扩增方法，适于对大量临床样本作检测之用。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

PCR法区别HBV RC—和CCC—DNA

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）和基因组为一松驰环状、部分双链ＤＮＡ（ＲＣ－ＤＮＡ）。在其负链的５与３端之间存在一缺口。当ＨＢＶ进入宿主细胞后，基因组转变为共价闭合环状ＤＮＡ（ＣＣＣ－ＤＮＡ）。我们根据ＨＢＶ－ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ的结构特点，设计了ＰＣＲ区别ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ。实验表明，该方法可有效地区别两种形式的ＨＢＶＤＮＡ》     

乙型肝炎血清学指标阳性母亲母乳HBV—DNA检测

随机取５０例乙肝血清学指标阳性母亲产后２－３ｄ人的初乳，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测初乳中ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果：抗原阳性组乙肝病毒（ＨＢＶ－ＤＮＡ）的检出率为５０％，抗体阳性组ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率为７．７％。抗原阳性组中，ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ及抗－ＨＢｃ３项阳性乾和ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ２基阳性者乳汁中ＨＢＶ－－ＤＮＡ检出率为１００％，说明该类乳汁具有极强传染性，抗体阳性组中单纯抗－ＨＢｓ     

聚合酶链反应在乙型肝炎病毒感染诊断中的意义

用ＰＣＲ法检测１６６例乙型肝炎病毒感染者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果显示：ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｃ阳性，ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ阳性和ＨＥｂＡｇ阳性组，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为９６．２％、２８．６％、９３．５％、ＨＢｓＡｇ单项阳性者中，检出ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性７８例（孕妇占１９．２％），阳性率８１．３％。另外，在２０例血清标志物全部阴性对照组中发现ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性１例，阳性率５．     

病毒与人类基因组同源性初探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引物，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行聚合酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明：有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增。ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４～２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增后的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在人类基因组中或两者具有很高的同源性。     

血清、白细胞HBV－DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＮＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

聚合酶链反应检测血清HBVDNA及其临床意义

应用聚合酶链反应检测２８１例各型乙型肝炎血清ＨＢＶＤＮＡ，检出率为６１．９％。ＨＢｅＡｇ阳性其ＨＢＶＤＮＡ检出率为９０．６％，说明ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢｅＡｇ有密切关系；抗ＨＢｅ阳性与抗ＨＢｓ阳性其ＨＢＶＤＮＡ检出率分别为３８．３％与３３．３％，提示ＨＢＶＤＮＡ并非完全消失，只是含量减少；ＨＢＶ－Ｍ均阴性者其ＨＢＶＤＮＡ检出率为５５．８％，表明在ＨＢＶ－Ｍ阴性的人群中亦可有ＨＢＶ感染。     

EB病毒3种全基因的扩增、克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、胸苷激酶及ＢＨＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ｐＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为转化的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳行为粗筛，再双酶切鉴定。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ），分别新出现一条分子大小为５２ｋｕ，６７ｋｕ及１７ｋｕ蛋白区带，符合ＥＢＶ该３种全基因所编码蛋白质大小。凝胶中蛋白质定量扫描结果显示目的蛋白质分别占宿主菌总蛋白质的２３％，６７％和２５％。结论：实现了ＥＢＶ３种全基因的扩增、克隆及在原核体系的表达。     

乙型肝炎血清学标志物阳性母亲初乳中HBV-DNA检测

目的探讨乙型肝炎血清学标志物阳性产妇的初乳中ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出与其血清中ＨＢＶ标志物携带状态的关系。方法对５１例乙型肝炎血清学标志物阳性产妇的血清及初乳，用酶免法检测ＨＢＶ－Ｍ，用ＰＣＲ法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ，并与２０例正常组进行对照。结果发现母血中传播性大的３项标志物：乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、乙型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及乙型肝炎核心抗体（抗－ＨＢＣ）中后两项易进入乳汁。３项阳性及ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ两项阳性产妇的初乳中ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率都高，而前者出现的例数更多（８／１０）。初乳中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者母血中的ＨＢｅＡｇ均为阳性。结论对乙型肝炎血清学标志物阳性的产妇，最好直接检测其乳汁中的乙肝三项及ＨＢＶ－ＤＮＡ，以指导哺乳。     

血清,白细胞HBV—DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从血清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

病毒与人类基因组同源性实探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引的，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明，有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增，ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４－２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在     

Lumiget PPD化学发光法检测HCMV DNA

在ＤＩＧ标记及检测系统中，以Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ作为ＡＰ底物，经ｄｏｔ－Ｂｌｏｔ杂交后进行化学发光法检测ＨＣＤＭＶ ＤＮＡ，并与ＮＢＴ义物显色法比较，结果显示：Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ法可检出０．１Ｐｇ，同源ＤＮＡ，非同源性ＨＢＶ ＤＮＡ，ＨＳＶ－Ⅰ，ＨＳＶ－Ⅱ，ＤＮＡ不能检出；Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ底物作用只需３ｈ即可获得清晰稳定的结果，优于ＮＢＴ底物显色法。     

非放射性分子杂交法检测HBV感染

用非放射性标记的ＨＢＶ－ＤＮＡ探针检测３７１份至少有一项ＨＢＶ免疫学标志阳性血清和５１０份对照血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果表明：５１０份对照血清和７９份仅抗－ＨＢｓ阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ均为阴性，８２份ＨＢｓＡｇ阳性、ＨＢｅＡｇ阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率为１００％，１０３份ＨＢｓＡｇ阳性、ＨＢｅＡｇ阴性血清的检出率为７９．６％，７６份ＨＢｓＡｇ阳性。ＨＢｅＡｇ阴性、但抗－ＨＢｅ阳性血清的检出率为８０．３％，２９２份ＨＢＶ不同感染阶段血清总检出率为７５％。非放射性分子杂交法可直接检测出ＨＢＶ的复制，由于该法亦可定量，故还可用于判断血清传染程度和血清病毒的含量。