神经干细胞在老年性痴呆模型鼠基底前脑内的成活和迁移

为探讨神经干细胞移植入老年性痴呆模型鼠基底前脑的成活和迁移情况,本研究利用无血清培养技术,加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(FGF-2)刺激生长,在体外进行神经干细胞的克隆培养,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记,采用免疫组化和免疫荧光法研究神经干细胞的增殖特性和多向分化潜能,用免疫组化和免疫荧光双标技术观察神经干细胞移植后在老年性痴呆模型鼠基底前脑的成活和迁移。结果显示:克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性反应。免疫荧光双标检测,贴壁的细胞为BrdU+GFAP阳性反应或者BrdU+NF阳性反应。移植后3周、4周,移植的针道附近以及整个基底前脑散在有许多BrdU+NF和BrdU+GFAP免疫荧光双标细胞。本研究结果提示,基底前脑神经干细胞能够分化为神经元和星形胶质细胞;基底前脑神经干细胞移植后能够在老年性痴呆模型鼠基底前脑内存活和迁移,可以与脑组织整合,并且能够分化成为神经元和星形胶质细胞。     

bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法：从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞，进行原代培养，分为bFGF组、EGF组、bFGF＋EGF组及对照组：培养过程中观察干细胞的生长，培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞，培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果：取材细胞大部分为nestin免疫阳性细胞；各实验组均可促进培养细胞的生长和分 化。免疫组化中，EGF使神经干细胞增殖成团，增加GFAP的表达（P＜0．01）；bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P＜0．01）；两种因子联合应用，神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P＜0．01）。结论：EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长，在分化方面，EGF倾向于诱导干细胞增并向着胶质细胞分化，bFGF则诱导干细胞分 成更多的神经元。     

bFGF对培养的基底前脑细胞表达NOS和NGFR的作用

目的:本实验研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对离体的基底前脑细胞表达一氧化氮合酶(NOS)和神经生长因子受体(NGFR)的影响。方法:用bFGF培养液和普通对照培养液对胚胎14天大鼠基底前脑细胞进行培养,分别取培养7、14、21天的神经细胞做NOS酶组织化学染色和NGFR免疫组织化学反应染色。结果:用bFGF培养液培养的神经细胞在14天和21天后NOS和NGFR阳性表达明显强于对照组。结论:bFGF可明显促进培养的基底前脑细胞生长并促进NOS和NGFR的表达。     

胚鼠神经干细胞培养与鉴定

目的　体外获取高浓度神经干细胞 (NSC)。方法　加入bFGF培养E12天大鼠胚脑的全部细胞 ,用荧光免疫组化法显示。结果　加bFGF的神经干细胞 (Neuralstemcell,NSC)大量分裂 ,形成大量的细胞分裂球 ,传到 4代时 ,90 %以上的细胞表达nestin。对照组分裂的细胞少 ,维持到第二代细胞逐渐死亡。结论　bFGF对胚胎E12天大鼠脑细胞的NSC有明显的促分裂作用 ,应用此种方法可获得高浓度的NSC     

T3对人神经干细胞分化为少突胶质细胞的影响

目的 以体外诱导生成的人神经干细胞(NSCs)为模型，研究甲状腺激素(TH)对其分化的影响。方法 无菌状态下取因治疗目的而终止妊娠的胎龄10～22周的人胎大脑半球，机械法分散细胞后，以10^5个／ml细胞密度接种于含N-2配方的DMEM／F12培养基中，同时添加表皮生长因子(EGF，20μg／L)和／或碱性成纤维生长因子(bFGF，20μg/L)。采用自然分化以及T3诱导的方法诱导分化，免疫组织化学方法鉴定分化后的细胞类型，抗体分别为NF-200、GFAP、Gal-C，并采用抗MBP、O4、A2B5抗体鉴别少突胶质细胞发育的不同阶段。结果 T3有助于向胶质细胞方向发展，包括少突与星形胶质细胞，MPB阳性细胞比例超过80％，尤其在EGF L组，这种现象更为突出。结论 NSCs的定时分化是内外源信号共同作用的结果。TH就是这样一种信号，激活“生物钟”机制的效应组件，在有限次的分化后诱导NSCs分化为少突胶质细胞。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2 以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与观察

目的 建立神经干细胞的分离，培养及分化鉴定技术；观察神经干细胞生长，增殖及分化的特点，方法 分离新生SD大鼠脑室下区的组织，经消化及机械吹打后，采用原代贴壁及传代悬浮的方法，培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，结果 从新生SD大鼠脑室下区分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具增殖的能力，原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性，分化后的细胞可表达神经元，星形角质细胞和少突角质细胞的特异性抗原。结论 用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

本研究旨在探索可促进成年大鼠神经干细胞增殖并形成较多的克隆球以及其分化出较多神经元的因素。取成鼠前脑室下区的组织进行原代培养 ,将之分为三组分别加入 EGF、b FGF以及 EGF+ b FGF,观察克隆球的形成状况。一周后收集三组原代细胞克隆球 ,加入完全培养液 (仅含 10 %胎牛血清 )进行分化实验。分化 14 d后 ,分别用 MAP-2和 GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,计算阳性细胞数量。无血清培养结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组原代培养液中形成的原代克隆球数量和直径的差别不明显 ,但都明显地大于 EGF组。免疫荧光结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组中的克隆球分化出 MAP-2阳性神经元的数量明显多于 EGF组 ,而 EGF组则能产生较多的胶质细胞。提示 ,b F GF能促进成年大鼠神经干细胞增殖 ,所形成的细胞克隆球能分化为较多的神经元。     

人前软骨干细胞体外分离培养及鉴定的实验研究

目的探讨体外分离、培养人前软骨干细胞（PSCs）的可行性,分析其表型特点,为相关的实验研究奠定基础。方法采用酶消化法从流产胎儿干骺端中收集细胞,用免疫磁性分选技术分离出前软骨干细胞,体外扩增培养,用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、RT-PCR等方法鉴定纯化后的PSCs。结果从流产胎儿干骺端中成功培养出人前软骨干细胞,细胞表面表达成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）标记物,细胞生长迅速。结论在体外培养条件下可以从流产胎儿干骺端中分离培养出较高丰度的前软骨干细胞。     

EGFP示踪NSCs海马移植对APP/PS1转基因鼠认知功能及基底前脑胆碱能神经元的影响

目的观察神经干细胞(NSCs)移植对APP/PS1双转基因小鼠认知功能及基底前脑胆碱能神经元的影响,并探讨其可能机制。方法体外分离培养EGFP转基因小鼠胎脑来源NSCs,24只12月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分入实验组(Tg-NSCs组)和AD对照组(Tg-AD组),每组12只,12只同月龄雄性野生型小鼠作为正常对照组(WT组),Tg-NSCs组进行EGFP示踪NSCs移植,其余两组进行等量磷酸盐缓冲液注射,移植部位为双侧海马区。移植4周后采用Morris水迷宫检测三组小鼠学习记忆功能,免疫荧光组化法和Western blot检测基底前脑胆碱能神经元的变化情况;Q-PCR检测海马神经营养因子NGF、BDNF、NT3的mRNA水平的变化。结果①体外悬浮培养的神经球表达EGFP阳性,免疫荧光检测显示神经干细胞特异性标志物Nestin阳性。移植4周后,可见EGFP阳性NSCs在海马注射移植部位存活并向胼胝体,海马深部和齿状回迁移,基底前脑未见EGFP阳性细胞。②与Tg-AD组相比,Tg-NSCs组基底前脑ChAT神经元及蛋白水平均增加(P<0.05),但ChAT蛋白表达低于WT组水平(P<0.05)。③Tg-NSCs组海马区神经营养因子NGF、BDNF、NT3的mRNA表达增加,高于Tg-AD组(P<0.05),且与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)。④水迷宫结果显示Tg-NSCs组学习记忆功能改善优于Tg-AD组(P<0.05),但仍低于WT组水平(P<0.05)。结论 NSCs海马移植并不能对该转基因鼠基底前脑胆碱能神经元丢失产生直接的替代与补充,可能通过分泌神经营养因子对基底前脑胆碱能神经元起到保护作用,从而促进其认知功能的恢复。     

Intracortical grafts of embryonic basal forebrain tissue restore low voltage fast activity in rats with basal forebrain lesions

Summary Unilateral injections of kainic acid into the basal forebrain in a series of rats resulted in an increase in large amplitude slow waves, a correlated burst-suppression pattern of multi-unit activity, and a decrease in acetylcholinesterase staining in the neocortex ipsilateral to the kainic acid injection. Subsequently, a cell suspension, prepared from rat embryonic basal forebrain tissue, was injected adjacent to the recording electrodes ipsilateral to the kainic acid injection. This produced a gradual recovery of low voltage fast activity (LVFA) and a correlated continuous discharge pattern of multi-unit activity in the neocortex ipsilateral to the kainic acid injection. LVFA recovered more slowly at neocortical recording sites that received an injection of a cell suspension of hippocampal primordial cells or no injection at all. Acetylcholinesterase-positive fibers from the basal forebrain tissue invaded host cortex; no comparable outrgrowths were demonstrable in the hippocampal primordium tissue grafts. Restoration of cholinergic electrocortical activation may play an important role in the improvements in behavioral performance produced by basal forebrain grafts in the cortex in animals with basal forebrain lesions.     

Nestin在成年大鼠基底前脑表达的鉴定

目的鉴定巢蛋白(Nestin)在成年大鼠基底前脑的表达。方法应用小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体(Rat401)对成年大鼠基底前脑进行了免疫组织化学研究和Westen-blot检测。结果Nestin免疫反应阳性神经元广泛分布于成年大鼠基底前脑的隔-斜角带(MS-DBB)复合体,基底前脑MS-DBB复合体的内侧隔核(MS)、斜角带垂直支(vDB)和斜角带水平支(hDB)分别有一相对分子质量约为240000的单一蛋白带。结论成年大鼠基底前脑MS、vDB和hDB均存在Nestin表达。     

成年大鼠基底前脑存在一个Nestin免疫阳性神经元簇

目的　观察Nestin免疫活性在成年大鼠基底前脑中的表达和分布 ,并探讨其与胆碱能神经元之间的关系。方法　采用免疫组化方法对成年大鼠基底前脑的切片进行nestin免疫组化染色及其与ChAT ,NADPH d双标染色。结果　在成年大鼠基底前脑的隔斜角带复合体有一个连续的nestin免疫阳性细胞带 ,胞体较大 ,梭形或多极形 ,有 2～ 4个突起。双标染色显示 ,Nestin阳性神经元与ChAT ,NADPH d阳性神经元间杂分布 ,大多数不呈交叉反应 ,只有少数 ,约 10 %呈双标染色。结论　成年大鼠基底前脑存在一个有别于胆碱能神经元的nestin免疫阳性神经元簇 ,其化学属性和生物学意义有待进一步研究。     

成年大鼠最后区神经干细胞的检测及鉴定

目的 观察性别决定基因高迁移率组蛋白( SOX2)和巢蛋白(Nestin)阳性表达细胞及溴脱氧尿密啶核苷（BrdU）阳性标记细胞在最后区的分布。方法 成年雄性SD大鼠12只,6~8周龄,随机分为两组,每组6只。一组大鼠按照50mg/kg（0.3ml）腹腔注射BrdU,连续3d给药,每天2次;另一组注射等量生理盐水。4d后灌注大鼠,行免疫组织化学及免疫荧光检测。 结果 免疫组织化学染色显示,SOX2阳性表达细胞在最后区的腹侧部呈明显的V字形分布,背侧部呈带状分布,中央部散在分布。Nestin阳性表达细胞在最后区的腹侧部呈明显的V字形强阳性分布,中央部呈弱阳性表达。在最后区可见少量阳性BrdU标记细胞。SOX2/BrdU荧光双标染色显示,SOX2阳性表达细胞较密集分布,可见少量SOX2/BrdU双阳性细胞。SOX2/Nestin荧光双标染色显示,SOX2阳性表达细胞较密集分布,可见少量SOX2/Nestin双阳性表达细胞。结论 最后区SOX2及Nestin阳性细胞密集表达,呈明显的区域分布;在最后区内存在少量BrdU阳性标记细胞及SOX2/BrdU和SOX2/Nestin双阳性细胞;最后区可能存在神经干细胞/祖细胞。     

用组织块法培养成年和老年鼠神经干细胞

目的　探索体外培养扩增成年及老年动物室管膜下区 (SVZ)神经干细胞的实用方法。方法　取 8、14及 2 4三个月龄SD大鼠SVZ组织块置含bFGF的DMEM/F12 +B2 7培养液培养 ,Nestin免疫组化法鉴定细胞表型。结果　各月龄的SVZ组织块均能长出Nestin阳性的神经小球及神经干细胞 ,培养 7～ 10天产生的神经球最多 ,神经干细胞状态最佳。结论　用含bFGF的培养基培养成年和老年大鼠SVZ组织块能产生较多的神经干细胞 ;此法是一种具有实用价值的培养、扩增神经干细胞的手段。     

依达拉奉干预永久性脑缺血大鼠神经干细胞增殖及分化

目的 探讨依达拉奉对永久性脑缺血大鼠脑内内源性神经干细胞的影响.方法 采用电凝法建立大鼠永久性脑缺血模型.将30只SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤组与依达拉奉组,每组10只,模型制作成功后6 h,1.5 g/L依达拉奉组腹腔注射依达拉奉(10 ml/kg),每天1次,假手术组与脑缺血组腹腔注射等体积的生理盐水,连续注射...     

Development of acetylcholinesterase-positive thalamic and basal forebrain afferents to embryonic rat neocortex

By combining anterograde and retrograde axonal tracing with AChE histochemistry, we demonstrate the sources of AChE-positive afferents to embryonic neocortex, the pathways they use, their time of arrival into cortex, and their initial invasion of the cortical plate. Acetylcholinesterase (AChE) is expressed by two populations of cortical afferents: AChE is permanently present in basal forebrain fibers and has been reported to be transiently localized in axons of the principal sensory thalamic nuclei over the first few postnatal weeks beginning at the middle of the first week. We first detect AChE-positive afferents histochemically in neocortex on embryonic day seventeen (E17) and determine that they arise from the principal sensory thalamic nuclei. AChE histochemistry labels the entire length of developing thalamocortical axons, including their growth cones and branches. These AChE-positive afferents enter the neocortex by the internal capsule and take an intracortical pathway centered on the subplate layer. As soon as these axons are detected, some have already begun to extend AChE-positive collateral branches superficially toward the cortical plate. By E19, a few collaterals have entered the deep part of the cortical plate and by E21 have densely invaded all but its most superficial undifferentiated part. AChE-positive afferents from basal forebrain structues reach the neocortex by three routes: the external capsule, the internal capsule, and the cingulate bundle. Among basal forebrain components, only the substantia innominata and nucleus basalis of Meynert reach the cortex by the internal capsule. Afferents from these two sources reach neocortex on E18, but are a very minor component of the total population of AChE-positive afferents at this age. Afferents from other basal forebrain components do not reach neocortex until several days later. The spatial and temporal patterns of AChE expression in developing thalamocortical axons indicate that it is useful for delineating their innervation of the primary sensory areas of embryonic neocortex, and suggest that AChE may function in axon extension and cortical differentiation.