细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析

目的 对细粒棘球蚴（中国大陆株）线粒体苹果酸脱氢酶（EgmMDH）重组质粒进行原核表达、纯化，并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性。方法 对已构建的基因工程菌株mMDH／pGEM—T／JM109进行酶切，获取目的基因。将目的基因重组到pET28a表达载体上，筛选阳性表达菌株并进行诱导表达，经SDS—PAGE鉴定重组mMDH蛋白质为包涵体后，超声破碎细胞，尿素溶解包涵体，镍柱亲和层析法纯化，获取重组蛋白。以纯化的mMDH作抗原免疫小鼠，用Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平。结果 成功构建原核重组表达载体mMDH／pET28a／BL21，并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA结果显示，重组抗原免疫小鼠诱导产生了一定水平的血清抗体；Westernblot显示，原头蚴、囊液等天然抗原能被重组抗原免疫的小鼠血清识别。结论纯化后的重组蛋白mMDH具有较强的免疫原性，有望作为包虫病候选疫苗，值得进一步深入研究。     

细粒棘球蚴(中国大陆株)抗原zw-5基因的表达、纯化及免疫学特性初步分析

目的对细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)抗原zw-5重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫学特性。方法从重组质粒Eg.zw-5/pGEM-T中获取抗原zw-5基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白;用Eg.zw-5免疫ICR小鼠,通过Western-blot、ELISA对Eg.zw-5的免疫学特性进行初步研究。结果构建原核重组表达基因工程菌株Eg.zw-5/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出分子量为28kD的重组蛋白。West-ern-blot显示,Eg.zw-5免疫的小鼠血清能识别重组蛋白和天然抗原原头蚴中约28KD处的条带。ELISA检测显示,用Eg.zw-5免疫小鼠,可诱导产生特异性抗体IgG。结论成功表达细粒棘球蚴重组抗原Eg.zw-5,该重组蛋白有较好的免疫原性及抗原性。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

细粒棘球蚴Eg95重组蛋白表达及其血清学反应的研究

目的 诱导表达和纯化细粒棘球蚴Eg95抗原重组蛋白,对其与CE病人血清学反应情况进行研究.方法 IPTG诱导pET28a-Eg95原核表达质粒,表达和纯化Eg95重组蛋白,SDS-PAGE 电泳对其进行初步鉴定,Western blot法检测其与中间宿主CE病人血清学反应情况.结果 pET28a-Eg95重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE 电泳显示相对分子量约为15kDa.Western blot 结果 表明,pET28a-Eg95重组蛋白能被CE病人血清识别,11例CE病人血清中8例呈阳性反应.结论 细粒棘球蚴Eg95抗原存在于中间宿主CE病人体内,Eg95蛋白作为保护性抗原可能成为CE病人术后辅助性治疗的手段之一.     

3种截短的泡球蚴Eml8基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定

目的 构建3种截短的泡球蚴18（Eml8）基因的原核表达质粒，获得高效表达、有生物活性的3种重组蛋白，并对其进行初步鉴定。方法 DNAman软件设计引物，PCR法扩增并构建3种截短的pET41a-Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性；IPTG诱导、表达和纯化rEml8．1-GST、rEml8．2-GST和rEml8．3一GST重组蛋白，SDS-PAGE电泳及Westernblot进行初步鉴定。结果 成功构建了3种截短的pET41a—Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3重组表达质粒；SDS-PAGE检测表明rEml8．1-GST、rEinl8．2-GST、rEml8．3-GST重组蛋白得到成功表达，在分子质量单位为41、45．5和45．5ku处有表达条带；Westernblot显示3种重组蛋白均能被AE病人血清识别。结论 成功构建了截短的pET41a-Eml8．1、pET41a-Eml8．2和pET41a—Eml8．3原核表达质粒，表达的3种重组蛋白均具有良好的抗原性，为Eml8抗原表位分析奠定了基础。     

细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶重组抗原的高效融合表达、纯化及免疫特性的研究

目的构建细粒棘球蚴重组蛋白谷胱甘肽s-转移酶(EgGST)的表达载体,获得纯化的重组蛋白,并对其免疫学特性进行初步鉴定,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法从本室已构建的重组质粒GST/pGEM-T中酶切下GST目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌BL21plys进行融合表达,经His-bind树脂纯化系统小量纯化,得到纯化的重组融合蛋白作为抗原。免疫ICR小鼠,获得抗血清。通过蛋白免疫印迹试验(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建具有高效表达能力的基因工程菌株,并纯化了重组蛋白,纯化的重组抗原免疫小鼠的抗血清可识别天然与重组抗原,实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。     

细粒棘球蚴Eg10基因的克隆、表达及免疫特性研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴分离株Eg10基因,并研究其重组蛋白的免疫特性。方法将细粒棘球蚴Eg10基因亚克隆于表达载体pET28a,转化重组质粒至大肠埃希菌BL21进行融合表达,His-bind树脂纯化系统纯化重组融合蛋白,以之作为抗原免疫小鼠。48只ICR小鼠随机均分为4组,A、B组为对照组,分别注射不含抗原的磷酸盐缓冲液(PBS)和福氏佐剂+PBS,每鼠皮下注射100μl。C、D组为免疫组,注射用福氏佐剂乳化的重组抗原Eg10,抗原量分别为0.1mg/μl和0.5mg/μl,每鼠皮下注射100μl。各组小鼠每隔2周免疫1次,共免疫3次。于免疫前和免疫后2、4、6、8和10周采血以获得抗血清。通过蛋白质印迹(Westernblotting)分析和ELISA检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建含目的片段Eg10的基因工程菌株。Westernblotting分析结果表明,免疫血清能识别重组抗原Eg10。ELISA检测结果显示,用重组蛋白免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。统计学分析表明,免疫后C、D组抗体水平逐渐升高,至第8周抗体滴度达最高值,分别为(1.143±0.253)和(1.254±0.070);A、B组抗体一直维持在较低水平。第2、4、6、8和10周,A、B与C、D组间抗体水平差异有统计学意义(均P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论成功表达细粒棘球蚴重组蛋白Eg10,该蛋白有一定的免疫原性。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定多房棘球绦虫重组BCGEm14—3—3疫苗。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT—PCR扩增获得Em14—3-3的cDNA，将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG的人结核分枝杆菌热休克蛋白（HSP）70启动子下游构建重组质粒pBCG—Em14-3—3，用电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗。将该疫苗接种到含12μg／ml、HgCl2的罗氏培养基筛选培养3周。结果 重组pBCG—Em14—3-3质粒经酶切证实构建成功，rBCG—Em14-3-3疫苗能在含12μg／ml HgCl2的罗氏培养基上生长繁殖。结论 成功构建多房棘球绦虫重组BCGEm14-3-3疫苗，为泡球蚴病的防治提供了一种新方法。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y2重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y2融合蛋白.重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y2在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人psoriasin蛋白的制备与鉴定

目的制备鉴定人psoriasin重组蛋白,为其作用机制的深入研究奠定基础。方法PCR法扩增人psoriasin基因,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,用Ni2＋-NTA凝胶亲和层析纯化目的蛋白,用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot法对重组蛋白的相对分子质量、纯度和免疫原性进行分析。结果psoriasin编码区基因扩增得到一306 bp特异条带,BLAST分析显示碱基无突变,阅读框架正确;SDS-PAGE显示纯化出相对分子质量为14 kD的重组psoriasin,纯度〉95%;Western blot显示该重组蛋白能与抗人psoriasin单克隆抗体发生特异性反应。结论psor-iasin重组蛋白成功制备,该蛋白具有较好的免疫活性,可用于进一步的研究。     

弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达

目的　体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白1433(Toxo1433)基因编码序列,构建原核表达质粒,并表达Toxo1433。　方法　收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取RNA,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RTPCR扩增Toxo1433基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。　结果　从弓形虫RH株RNA中扩增出803bp的Toxo1433基因片段,构建重组质粒pET28a/1433;IPTG诱导,SDSPAGE显示表达产物的大小约30.7kDa,Western印迹鉴定为Toxo1433。　结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了1433基因,构建了pET28a/Toxo1433重组质粒,并获得高效表达。     

细粒棘球绦虫FABP与Eg95融合基因的表达与抗原性鉴定

目的构建细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白(FABP)和Eg95两个保护性抗原基因的融合基因,并研究其重组蛋白的免疫学特性。方法以细粒棘球绦虫青海绵羊株保护基因FABP和Eg95的cDNA为模板,通过编码4个甘氨酸残基的连接序列,用非对称聚合酶链反应扩增融合基因FABP·Eg95,克隆至表达载体pET28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DB3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。通过Ni-IDA亲和层析获得高纯度目的蛋白,利用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫反应性。结果获得的融合基因FABP·Eg95长约795bp,双酶切和测序鉴定结果均显示pET-28a(+)-FABP-Eg95重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠埃希菌BL21(DB3)中获得高效表达,表达相对分子质量(Mr)约为31000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果显示,重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清有良好的免疫反应性,而不与健康人血清和血吸虫病患者血清反应。结论 FABP·Eg95融合基因构建成功,纯化的重组蛋白具有一定的抗原性。     

猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法 通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果 成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3.3多克隆抗体,其效价为1∶512 000。Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论 成功制备猪带绦虫重组Ts14-3-3.3蛋白,并获得了高纯度、高效价的兔多克隆抗体。