山羊干扰素-γ的克隆、原核表达及其抗血清的制备

应用RT-PCR方法从免疫过山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊干扰素-γ（IFN-γ）基因，经序列测定，其开放阅读框架共有501bp，推测其分子质量（MW）为19.327KD。该基因与GenBank发表的山羊干扰素-γ基因序列（U34232）比较，核苷酸序列同源性为99.4%。经SignalP3.0分析表明，前23个氨基酸为信号肽序列。将信号肽序列去除并克隆到原核表达载体pET30a（＋）上，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳，结果表明该基因在大肠杆菌中以包涵体形式融合表达。用ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化并免疫新西兰兔，制备了兔抗山羊IFN-γ多克隆血清。经WesternBlot鉴定，多克隆抗血清可与纯化的山羊IFN-γ蛋白发生特异性反应，说明该重组蛋白具有抗原活性，为我们进一步研究其在疾病诊断和免疫评价方面的应用奠定了基础。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1亚基，制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板，设计引物，将聚合酶链反应（PCR）扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中，1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱亲和纯化，用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白，用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术（Western blot）分析，证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达，为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

人Tenascin-Raa454-1069蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的人Tenascin-R EGFL结构域（Tenascin-Raa454-1069）的融合蛋白,并制备相应的兔源性多克隆抗体（pAb）。方法 利用PCR从PMD18-T-TNR获得Tenascin-Raa454-1069编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-Tenascin-Raa454-1069融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清, Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果 成功构建了pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069原核表达载体,原核蛋白Tenascin-Raa454-1069以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的融合蛋白,蛋白浓度为1 600mg/L,制备的抗Tenascin-Raa454-1069多抗效价高达1∶1.6 ×106,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论 获得高纯度Tenascin-Raa454-1069蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究Tenascin-R的生物学功能提供实验基础。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

Parkin蛋白C端的表达及抗体的制备

目的：构建Parkin基因3‘端的表达质粒，在大肠杆菌中表达并制备多克隆抗体。方法：构建Parkin基因3‘端（937－1959bp）的谷氨酰胺硫转移酶（glutathion-sulfate-transferase,GST)融合表达质粒，在JM105中获得表达。用Triton-100(1%）和Tween-20(1%）处理，并用亲和层析纯化表达产物。将其免疫新西兰兔，用免疫印迹分析收获的兔抗血清。结果：构建的ParkinC表达质粒在JM105中获得表达，以分子量为42kD的包涵体存在；目的蛋白纯度为95％；得到效价为1：64的抗血清；免疫印迹分析表明，制备的抗血清可与鼠脑细胞抽提物中51.6kD的蛋白产生特异的免疫反应。结论；Parkin蛋白C端在JM105中获得高铲表达并得到特异性多克隆抗体。     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体.方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经NiNTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度.结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中.纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度＞l:32 000.结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础.     

肿瘤血管导向肽与人突变IL-2融合蛋白的克隆、表达及生物学活性分析

目的获得具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽（NGR）融合表达的突变人IL-2蛋白.方法将突变人IL-2与NGR的融合基因重组到表达载体pET-22b（＋）并转化E.coli BL21（DE3）,测序正确后,IPTG诱导表达,并对产物进行纯化、复性和鉴定.结果目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%以上,Western blot分析显示纯化后的目的蛋白具有免疫结合活性,CTLL-2细胞增殖实验证明具有生物学活性.结论具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽融合表达的重组人IL-2蛋白可成功地克隆并表达,为进一步的肿瘤导向治疗打下基础.     

重组人 HER3 胞外域Ⅰ区 183-227aa 的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3（HER3）183-227aa肽段（HER3Ⅰ）和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段（MVF）融合构建的重组肽（MVF-HER3Ⅰ），并制备其多克隆抗体。方法 将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ，用化学合成法合成重组肽基因，并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白（Trx）基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒，重组质粒用双酶切法鉴定。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）并进行表达参数优化及诱导表达。融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽。表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析。以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体。用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价，免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别，激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7 细胞的结合，磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用。结果 成功构建了重组肽的两种表达质粒，重组肽基因不能单独表达，但和Trx融合后可在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG条件下呈可溶高表达。融合蛋白经亲和层析、酶切和再次亲和层析后得到重组肽。重组肽可刺激大鼠产生效价达1:512 000的抗重组肽多克隆抗体。该抗体不仅可特异性识别重组肽,还可特异性沉淀非变性HER3和结合于MCF7细胞的细胞膜。不管有无神经调节素刺激，该抗体均呈浓度依赖性地抑制HER3高表达的MCF7细胞的增殖（P<0.01）。结论 成功进行了重组肽 MVF-HER3Ⅰ的原核表达和纯化，制备并鉴定了抗MVF-HER3Ⅰ多克隆抗体，为在体内外深入研究该抗体对HER3信号通路的影响打下基础。     

重组表达幽门螺杆菌致病岛CagL蛋白及其中和抗体初步研究

目的 重组表达幽门螺杆菌(Helicobacterpriori,Hp)cagL基因,并制备兔抗多克隆抗体及阻断Hp黏附宿主细胞实验.方法 用PCR方法 扩增出cagL基因片段,将目的 基因构建至表达载体pET22b中并诱导表达.采用亲和层析法纯化蛋白,以纯化蛋白为抗原免疫家兔,制备兔抗CagL多克隆抗体血清,并用多克隆抗体血清进行阻断坳黏附宿主细胞实验及细胞因子IL-8活性分析.结果 成功构建表达纯化了CagL重组蛋白,制备CagL蛋白兔抗多克隆血清,并初步验证了多克隆抗体血清在体外和Hp黏附作用的关系.与对照菌相比,重组菌CagL在25 X 103.附近均出现新的蛋白表达条带,且诱导6 h时表达量最高.UVP扫描分析目的 蛋白占菌体总蛋白的35%～40%.SDS-PAGE显示重组蛋白CagL主要以包涵体形式存在于超声沉淀中.ELISA结果显示兔抗CagL多克隆抗体的滴度为1:16 000 EU.Giemsa染色后显微镜观察可见坳菌与HeLa细胞呈典型的聚集性黏附,抗体中和后Hp与HeLa细胞未见黏附,加入DH5α的HeLa细胞也未见细菌黏附.结论 多克隆抗体血清对Hp黏附定植有一定阻断作用,并且可以减少Hp促进细胞分泌IL-8的能力.     

结核分枝杆菌黏附素HBHA的克隆表达及其免疫原性研究

目的应用克隆表达技术从大肠杆菌中获得重组的结核分枝杆菌黏附素HBHA蛋白,并以HBHA免疫小鼠观察抗HBHA抗体的产生并探讨其免疫原性。方法1)应用PCR技术扩增结核分枝杆菌hbhA编码基因的特异片段。2)结核分枝杆菌hbhA编码基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。3)应用克隆表达的HBHA蛋白免疫小鼠,并用ELISA法测定小鼠血清抗HBHA抗体水平。结果1)结核分枝杆菌hbhA基因成功地克隆到PET-32 a(+)表达载体中,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组HBHA主要存在于包涵体中,纯化包涵体并获得了大量的重组HBHA。2)重组HBHA免疫小鼠可产生较高水平的抗HBHA抗体(>1∶102 400),表明重组HBHA在纯化过程中仍保留较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌黏附素HBHA具有较好的免疫原性。     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。     

人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的：将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1（XBP1u）的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法：重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l（DE3）,在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2＋-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果：XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论：成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.