线粒体DNA缺失HepG2细胞系的建立、鉴定及放射生物学特性

目的为研究人肝癌细胞系HepG2 线粒体DNA（mtDNA）缺失后的放射生物学特性,建立并鉴定mtDNA缺失HepG2
（ρ0HepG2）细胞系。测定辐射干预下mtDNA缺失（Rho0）肝癌细胞的凋亡情况、侵袭能力以及辐射敏感性的变化。方法在含
有溴化乙锭（EB）、丙酮酸、尿嘧啶的特殊培养基中培养HepG2 细胞,经30 次传代后,有限稀释法筛选完全去除mtDNA的克
隆。去除丙酮酸及尿嘧啶后,观察细胞的存活情况。PCR法鉴定mtDNA的缺失。用6MvX射线梯度剂量照射HepG2 细胞
和ρ0HepG2细胞,平板克隆法绘制生长曲线,线性二次方程拟合生存曲线,计算α/β。2Gy剂量辐射细胞,24 h后用Hochest33342
细胞核染色,比较HepG2细胞与ρ0HepG2凋亡率的差异。用Transwell法测定两种不同细胞的侵袭能力。结果在含EB特殊培
养环境下,HepG2细胞可持续生长传代至30代,去除丙酮酸和尿嘧啶后,细胞短时间内大量死亡。经PCR法证实mtDNA完全
缺失。ρ0HepG2细胞α/β显著低于正常HepG2细胞,辐射抵抗能力增强。辐射干预后ρ0HepG2的凋亡比例显著减少。ρ0HepG2
穿膜细胞数显著增多。结论在EB长期诱导下,HepG2肝癌细胞可被成功诱导为mtDNA缺失细胞。ρ0HepG2细胞的辐射抵抗
性显著增强,抗凋亡能力及侵袭能力均提高。
     

线粒体DNA缺失对肿瘤细胞生物学表现的影响的研究进展

<正>多种肿瘤细胞的线粒体DNA缺失细胞(ρ0细胞)被培养出来且被发现具有与亲代肿瘤细胞不同的生物学表现,提示线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)缺失可对肿瘤产生影响。然而mtDNA缺失对肿瘤发生发展的具体影响方面及其作用机制还需要进一步深入探讨。ρ0细胞是一类线粒体内DNA缺失,无线粒体功能的细胞系;研究者们针对mtDNA相较于核     

诱导细胞mtDNA缺失以及再转入线粒体后对肿瘤细胞凋亡的影响

目的 对比研究mtDNA缺失以及再转入线粒体后细胞凋亡的变化.方法 在成功构建ρ_0SK-Hepl细胞和转线粒体细胞SK-HeplCyb的基础上,采用Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ψm);Western blot检测细胞Bcl-2、Bax表达水平;免疫荧光染色观测Bel-2细胞内分布.结果 SK-Hepl、ρ~0SK-Hepl和sK-HeplCyb细胞凋亡率分别为(2.01±0.11)%、(0.37±0.08)%和(2.10±0.12)%.ρ~0SK-Hepl对细胞凋亡有明显抗性(P<0.05).ρ~0SK-Hepl细胞内DCFDA荧光强度较SK-Hepl细胞显著增强(35.5与15.9,P<0.01);转入线粒体后,SK-HeplCyb细胞DCFDA荧光强度较ρ~0SK-Hepl细胞明显下降(17.4与35.5,P<0.01).ρ~0SK-Hepl细胞MitoTracker Red荧光强度较SK-Hepl细胞显著减低(55.0与65.9,P<0.05);转入线粒体后,SK.HeplCyb细胞MitoTrack-er Red荧光强度与SK-Hepl细胞基本一致(67.4与65.9,P>0.05).ρ~0SK-Hepl细胞线粒体Bcl-2、Bax表达增多,Bcl-2/Bax比值增加(P<0.01).SK-HeplCyb细胞线粒体Bcl-2/Bax值下降.结论 mtDNA缺失肿瘤细胞对细胞凋亡有明显拮抗.Bcl-2线粒体转位、线粒体Bci-2/Bax值增加、ROS产生增多可能参与细胞凋亡拮抗的形成.     

抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性对结肠癌细胞Caco2迁移侵袭能力的影响

目的：探讨抑制线粒体呼吸链复合物I活性对结肠癌细胞Caco2迁移侵袭能力的影响及其可能的机制。方法：体外培养的Caco2给予线粒体呼吸链复合物I活性抑制物鱼藤酮处理,采用比色法检测线粒体呼吸链复合物I的活性;通过Transwell小室实验检测Caco2细胞迁移、侵袭能力;通过流式检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果：鱼藤酮干预Caco2细胞48hr后,胞内线粒体呼吸链复合物I活性显著低于对照组;Transwell实验结果显示,鱼藤酮干预组细胞的迁移率(P<0.01)及侵袭率(P<0.05)均显著高于对照组Caco2细胞;鱼藤酮干预组Caco2细胞内ROS水平显著高于对照组Caco2细胞(P<0.01)。结论：抑制线粒体呼吸链复合物活性I可能通过增加胞内ROS水平的方式显著增强结肠癌细胞的迁移侵袭能力。     

Furin抑制剂α1-PDX对宫颈癌HeLa细胞生长、转移和成瘤的影响

目的研究α1-PDX对宫颈癌细胞株HeLa细胞生长、转移及成瘤的影响并探讨其机制。方法α1-PDX转染HeLa细胞,通
过MTT细胞增殖实验,Boyden细胞迁移和侵袭实验观察HeLa细胞的生长,迁移和侵袭能力。采用蛋白印迹法检测细胞Furin
及产物膜性Ⅰ型金属蛋白酶（MT1-MMP）蛋白量的变化,荧光酶底物实验检测Furin活性。制作HeLa细胞致瘤裸鼠模型研究
肿瘤体内生长。结果细胞增殖实验结果显示,与对照组相比24 h α1-PDX组HeLa细胞体外生长抑制18.4%,差异有统计学意
义（P<0.01）;细胞迁移和侵袭实验结果显示,α1-PDX处理组穿过滤膜和基质胶的HeLa细胞数量均明显少于对照组（P<0.01）;
HeLa/PDX可显著降低Furin的活性和MTI-MMP的蛋白水平。HeLa/PDX致瘤裸鼠的成瘤机率及皮下肿瘤体积明显小于对照
组。结论α1-PDX可有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长、转移及成瘤能力,机制可能与降低Furin活性及产物MTI-MMP的表
达有关。
     

KLK10基因表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力

目的探讨人组织激肽释放酶10（KLK10）对舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用分子生物学技术,构建真
核表达载体pIRES2-EGFP-KLK10,转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测KLK10mRNA及蛋白表达水平。
MTS细胞生长实验检测细胞增殖的变化;Transwell小室细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果pIRES2-EGFP-KLK10
转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,KLK10mRNA及蛋白表达水平均明显增高,KLK10增强表
达的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P<0.05）。结论KLK10表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。KLK10
基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点。
     

原花青素上调let-7a抑制胰腺癌AsPC-1细胞生长及迁移

目的探讨原花青素是否通过上调let-7a表达而抑制胰腺癌细胞生长及迁移。方法体外培养人胰腺癌AsPC-1细胞,原花
青素处理细胞后,分别用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染及Transwell迁移等实验检测细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移能
力的改变;利用miRNA实时逆转录PCR检测细胞内let-7a表达变化。AsPC-1细胞转染let-7a mimics后,MTT法、Transwell迁
移实验分别检测细胞增殖率及细胞迁移能力的改变。结果与对照组相比,原花青素处理AsPC-1细胞后,细胞增殖率、细胞迁
移能力随着原花青素浓度升高而下降,而细胞凋亡率随着药物浓度升高而逐渐升高。与对照组相比,原花青素处理细胞后,
let-7a的表达升高。通过脂质体转染let-7a mimics后,细胞的增殖率及迁移能力均低于对照组,且let-7a mimics 与原花青素共
同作用后,细胞增殖及迁移明显低于let-7a mimics和原花青素单独作用组。结论原花青素具有抑制胰腺癌细胞生长、迁移,及
诱导细胞凋亡的作用。原花青素可能是通过上调let-7a表达,从而抑制胰腺癌细胞的生长及迁移。
     

线粒体DNA缺失肝癌细胞内活性氧、线粒体膜电位变化实验研究

目的 比较活性氧、线粒体膜电位在线粒体DNA缺失肝癌细胞株SK-Hep1(ρ0SK-Hep1)与亲本细胞中的差别.方法 采用溴化乙锭诱导制备ρ0SK-Hep1细胞株;荧光探针标记、流式细胞计数及激光共聚焦显微镜方法检测细胞内活性氧和线粒体膜电位.结果 ρ0SK-Hep1细胞内活性氧荧光强度显著高于其亲本SK-Hep1细胞株(P＜0.01),ρ0SK-Hep1肝癌细胞平均计数35.5,而SK-Hep1肝癌细胞平均计数15.9.ρ0SK-Hep1细胞线粒体膜电位显著低于亲本细胞(P＜0.01),ρ0SK-Hep1细胞平均计数55.0,而SK-Hep1细胞平均计数65.9.结论 线粒体DNA缺失后细胞内活性氧水平增加,而线粒体膜电位有所减低.     

细胞融合法转线粒体细胞模型的构建及鉴定

目的 探讨细胞融合方法建立转线粒体细胞(cybrid)可行性,并对融合后细胞内mtDNA进行鉴定.方法 采用细胞融合方法将正常人血小板与mtDNA缺失人肝癌细胞(ρ°SK-Hep1)融合,建立转线粒体细胞(SK-Hep1 Cyb),恢复细胞正常线粒体功能.并用PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体膜电位检测进行鉴定.结果 PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体染色证实成功建立了ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb.结论 采用细胞融合法可以建立转线粒体细胞,融合细胞恢复线粒体功能,转线粒体细胞可稳定存活30d以上.     

Id1/Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用

目的探讨DNA分化抑制因子（inhibitor of DNA differentiation, Id）Id1/Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞
增殖、侵袭、迁移及粘附等生物学行为的作用。方法Western blot方法检测4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Id1/Id3
的表达;将子宫内膜癌RL-952和HEC-1-B两株细胞各分为未处理细胞组、空白病毒组、启动子病毒组和Id1/Id3双敲低组。通
过qRT-PCR检测不同腺病毒载体感染细胞后MMP2、CXCR4和P21 mRNA表达量,Western blot检测MMP2、CXCR4、P21蛋白
表达情况;通过MTT增殖试验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和细胞粘附实验检测Id1/Id3表达改变后,对子宫内膜癌细胞
增殖、侵袭、移行和粘附能力的影响。结果Id1/Id3在子宫内膜癌组织中较癌旁组织表达增高（P<0.05）;双敲低Id1/Id3,子宫内
膜癌细胞中MMP2、CXCR4的mRNA水平和蛋白水平明显降低（P<0.05）,P21的mRNA水平和蛋白水平则明显升高（P<0.05）,
RNAi组与其他3组细胞相比均有显著性差异;Id1/Id3双敲低组子宫内膜癌RL-952和HEC-1-B株细胞增殖能力、侵袭能力、迁
移能力和粘附能力均抑制（P<0.05）。结论Id1/Id3在子宫内膜癌患者组织中高表达,并可通过升调MMP2、CXCR4和降调P21
的表达促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移及粘附作用,靶向Id1/Id3治疗可能成为预防和治疗子宫内膜癌的新方案。
     

无血清培养CD133+Colo205大肠癌细胞可高表达ALDH1

目的通过观察含生长因子的无血清培养基（serum-free medium, SFM）培养的Colo205细胞,研究其对CD133与ALDH1
表达的影响。方法用含生长因子的无血清培养基对Colo205 细胞进行培养,以含血清培养基（serum-supplimented medium,
SSM）组作为对照,流式细胞术检测两组细胞表面标志物CD133表达的阳性率;流式分选SFM组CD133+细胞和CD133-细胞,倒
置显微镜观察CD133+细胞和CD133-细胞在无血清培养基中的生长特性;利用细胞免疫荧光检测CD133+细胞和CD133-细胞
CD133和ALDH1的表达;分别将CD133+细胞和CD133-细胞在NOD/SCID小鼠皮下进行成瘤实验,采用免疫组织化学方法对
肿瘤组织检测ALDH1表达。结果SFM组CD133+细胞比例明显高于SSM组（P<0.05）;CD133+细胞在SFM中可以形成肿瘤干
细胞球,而CD133-则不能形成;CD133+细胞高表达CD133和ALDH1,且两者共表达,而CD133-细胞则是阴性表达;CD133+细胞
和CD133-细胞成瘤后,CD133+细胞组肿瘤组织ALDH1阳性表达,而CD133-细胞组阴性表达。结论含生长因子的无血清培养
基培养CD133+Colo205大肠癌细胞能够形成肿瘤干细胞球及高表达ALDH1,ALDH1可能是大肠癌干细胞候选的标志物之一。
     

卵巢储备功能下降患者颗粒细胞mtDNA拷贝数 及4 977 bp缺失的研究

目的：研究卵巢储备功能下降（DOR）患者颗粒细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数和4 977 bp缺失情况,初步探讨DOR患者颗粒细胞mtDNA结构的完整性。方法：选取DOR组及对照组各50例,分离提纯卵泡液中颗粒细胞,提取DNA,RT-PCR相对定量颗粒细胞mtDNA拷贝数及PCR检测其4 977 bp缺失情况。结果：DOR组及对照组均未检测到mtDNA 4 977 bp缺失,其拷贝数相对量差异亦无统计学意义（P＞0.05）。结论：DOR患者颗粒细胞mtDNA结构基本完整,颗粒细胞可作为DOR患者卵母细胞浆内线粒体自体移植的供体细胞。     

Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗易于出现mtDNA缺失突变-ROS对组织损伤的特异性研究

目的　探讨ROS对各种组织mtDNA的损伤情况 ,耳蜗mtDNA是否为ROS损伤的标靶。方法　应用套式PCR及分子克隆测序技术对 10只Sod1基因敲除小鼠及 5只同系野生型小鼠耳蜗、脑、肝脏、肾脏、脾脏、心脏及皮肤组织进行研究。结果　 1 各组织mtDNA可检测到 3种缺失 ,常见的缺失为mtDNA386 7bp和mtDNA372 6bp缺失 ,mtDNA4 2 36bp缺失不常见。 2 mtDNA缺失在不同组织的含量有明显的不同 ,肝脏和肾脏组织含量最高 ,耳蜗、心脏和大脑组织其次 ,脾脏及皮肤组织含量最低。与野生型小鼠比较 ,Sod1基因敲除小鼠mtDNA在不同组织的缺失量是野生型小鼠的 3- 2 0倍 ,其中耳蜗组织mtDNA缺失量约是WT小鼠的 15倍。结论　缺乏Sod1的保护 ,ROS可以攻击各种组织mtDNA ,但具有明显的组织特异性 ,耳蜗mtDNA是其损害的敏感标靶。     

Delta mtDNA4977 is more common in non-tumoral cells from gastric cancer sample

BACKGROUND: The aim of this study was to determine the frequency of delta mtDNA4977 in tumoral cells as compared with adjacent normal cells in gastric cancer. METHODS: In order to investigate whether a high incidence of mutation exists in mitochondrial DNA of gastric cancer tissues, we screened one of common region of the mitochondrial genome by PCR amplification and Southern blot followed by DNA sequence analysis. DNA isolated from these cells was used to amplify hypervariable regions ATPase8/6, COXIII, ND3, ND4 and ND5 of delta mtDNA4977. RESULTS: In 107 cancer patients, delta mtDNA4977 was detected in 6 cases (5.60%) of the tumoral tissues and 18 cases (16.82%) of the non-tumoral tissues that were adjacent to the tumors. Levels of delta mtDNA4977 deletions were found to be more in non-tumoral tissues than in adjacent tumoral tissues. There was no correlation of patients with certain clinical parameters like age, sex, tumor location and tumor size; however, there was an obvious relationship with intestinal-type of gastric cancer. CONCLUSIONS: Unknown genetic aspects, ambiguous environmental factors and reactive oxygen species (ROS) can cause the delta mtDNA4977 mutation rate to be increased in gastric cancer. The results suggest that percentage level of delta mtDNA4977 is less common and intolerable in tumoral tissue, probably because of high metabolism and ROS generation. We supposed that the cells initially had delta mtDNA4977 transform to tumoral cells and the existed deletion conferred metabolic disadvantage; thus, cells containing such a mtDNA deletion would be overgrown by other cancer cells without this mtDNA deletion. As a result, the presence of delta mtDNA4977 will be low in tumoral cells.     

Identification of Two Novel Mitochondrial DNA Deletions Induced by Ionizing Radiation

ObjectiveWe identify ionizing radiation-induced mitochondrial DNA (mtDNA) deletions in human lymphocytes and their distribution in normal populations.MethodsLong-range polymerase chain reactions (PCR) using two pairs of primers specific for the human mitochondrial genome were used to analyze the lymphoblastoid cell line following exposure to 10 Gy ⁶⁰Co γ-rays. Limited-condition PCR, cloning and sequencing techniques were applied to verify the mtDNA deletions detected with long-range PCR. Human peripheral blood samples were irradiated with 0, 2 and 6 Gy ⁶⁰Co γ-rays, and real-time PCR analysis was performed to validate the mtDNA deletions. In order to know the distribution of mtDNA deletions in normal population, 222 healthy Chinese adults were also investigated.ResultsTwo mtDNA deletions, a 7455-bp deletion (nt475-nt7929 in heavy strand) and a 9225-bp deletion (nt7714 -nt369 in heavy strand), occurring between two 8-bp direct repeats, were identified in lymphoblastoid cells using long-range PCR, limited-condition PCR and sequencing. These results were also observed for ⁶⁰Co γ-rays irradiated human peripheral blood cells.ConclusionTwo novel mtDNA deletions, a 7455-bp deletion and a 9225-bp deletion, were induced by ionizing radiation. The rate of the mtDNA deletions within a normal population was related to the donors' age, but was independent of gender.     

血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞侵袭能力的影响

目的:研究血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结高转移细胞的运动迁移和侵袭能力的影响。方法:建立卵巢癌淋巴结高转移细胞(SKOV3-PM4)、人脐血管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVEC)条件培养基的交互培养体系,通过MTT法测定生长曲线,HE染色观察细胞超微结构的改变,Transwell穿膜运动实验、划痕实验、明胶酶谱分析等实验方法研究交互培养后各组细胞的侵袭转移能力的变化。结果:与同期单独培养的SKOV3-PM4、HUVEC相比,交互培养后的SK-OV3-PM4伪足增多,生长速度明显快于SKOV3-PM4,交互培养后HUVEC呈不规则形态,出现空泡化超微结构,生长速度与HUVEC相似,细胞的运动和侵袭能力增强,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在单独的SKOV3-PM4中低表达,在HUVEC中不表达,在共培养的SKOV3-PM4-HUVEC中高表达。结论:HUVEC上清液培养后的SKOV3-PM4的生物学行为和运动侵袭能力发生改变,推测可能与血管内皮分泌的VEGF、MMP-2等因子有关。     

白蛋白和放置时间对细胞因子诱导杀伤细胞活性的影响及简易检测方法

目的研究细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）回输液中添加白蛋白和放置时间对其活性的影响,并建立简捷的CD3+CD56+细
胞生成率及细胞死亡率的检测方法。方法（1）抗CD3-FITC和抗CD56-PE同时标记CIK细胞,或FQ-AE染色CIK细胞,荧光显
微镜观察并记录;（2）悬浮液中加或不加白蛋白,Annexin V-FITC标记CIK细胞,不同时间段取样,流式细胞仪检测。结果（1）
食道癌患者CIK细胞集落小,散在分布;胰腺癌患者CIK细胞集落大且集中;（2）显微镜可观察并计数CD3+CD56+细胞;（3）回输
液中加与不加白蛋白的凋亡率及死亡率均无显著差异;（4）CIK细胞在培养箱外放置,0~90 min之间样品与150 min样品之间凋
亡细胞数差异显著,细胞死亡率与放置时间无显著差异。结论（1）不同肿瘤患者CIK细胞的生长集落不同;（2）抗CD3 和抗
CD56标记可计数CD3+CD56+CIK细胞生成率,FQ-AE染色可计数死亡细胞比率,检测方法简便、快捷;（3）CIK细胞回输液中可
不加白蛋白,对细胞存活率无影响;培养箱外放置时间90 min之内为宜,时间越短越好。