一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

目的建立一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法。方法以荧光纳米颗粒作为示踪标记物,采用双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌A蛋白,制备了稀土离子标记的免疫层析试纸条,在紫外激发光源下判断反应结果。对该方法的特异性、敏感性和样本检测的适用性进行了分析。结果所制备的试纸条具有良好的特异性,与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌、O1/O139群霍乱弧菌、副溶血性弧菌均无交叉反应。用该试纸条检测纯菌液和未经培养的粪便、呕吐物的灵敏度为7.2×104CFU/ml,检测经培养的模拟污染食物样本、粪便样本的检测限最低为7.2×102CFU/ml,反应在15 min内完成。结论本研究成功建立了金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测食品、奶制品、呕吐物、粪便中的金黄色葡萄球菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

O139霍乱弧菌快速检测试纸条临床效果评价

目的 评价O139霍乱弧菌快速检测试纸条的临床使用效果。方法 采集腹泻病人及霍乱病人的密切接触者粪便标本，分别做O139霍乱弧菌快速检测试纸条和常规细菌分离培养，以后者为金标准，计算O139霍乱弧菌快速检测试纸条的灵敏度和特异度。结果 O139快速检测试纸条的灵敏度为100％，特异度为95．20％，约登指数为0．95，阳性预测值为46．67％，阴性预测值为100％。结论 O139霍乱弧菌快速检测试纸条可做为一种筛检方法在临床推广使用。     

一起 O139群霍乱疫情的实验室检测方法探讨

目的寻求适合 O139群霍乱疫情的病原学检测方法,以便为 O139群霍乱疫情的防控提供及时可靠的科学依据。方法用实时荧光定量PCR仪进行 O139群霍乱弧菌的核酸检测、常规分离培养、 O139群霍乱弧菌快速检测（胶体金法）。结果O。群霍乱弧菌的核酸检测阳性结果9份,且从这9份标本中分离到阳性菌株9株,有7份试样第一次增菌液胶体金法呈阳性反应,2份试样经过第二次增菌后胶体金法才呈阳性反应。结论实时荧光定量PCR法和胶体金法作为辅助检测 O139群霍乱弧菌的方法,可以较快得到初步结果,将两种方法与传统的分离培养鉴定相结合,可以保证结果的及时性和准确性。     

Taq-Man实时荧光定量PCR同时检测O1和O139群霍乱弧菌

目的针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因建立能够快速、准确地同时检测O1和O139群霍乱弧菌的荧光PCR检测方法,并克服常用PCR检测方法中经常出现的假阳性现象。方法分别以rfbM和wbfR基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针,通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群和O139群霍乱弧菌的二联实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)。对该方法的特异性、灵敏度进行评估,并对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测。结果特异性试验表明,该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌,能有效地避免O141群霍乱弧菌和拟态弧菌的假阳性,特异性为100%;灵敏度试验表明,O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌检出限分别为92cfu/ml和116cfu/ml;另外,试验建立的检测方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致,符合率为100%。结论该实时荧光PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌,而且特异性好、灵敏度高,能有效克服假阳性,适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断。     

实时荧光RT-PCR方法检测水及水产品中霍乱弧菌

〔目的〕探索实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌检验方面是否比传统方法有优势。〔方法〕用深圳太太基因工程有限公司提供的霍乱弧菌实时荧光RT-PCR试剂盒方法进行检验。〔结果〕用实时荧光RT-PCR方法从样品的2次增菌液中检出2个样品为霍乱弧菌通用型阳性。用传统的微生物生理、生化培养法,从上述2个样品中分离出3株菌株。根据血清分型、API鉴定和荧光RT-PCR,确认所分离的菌株有2株是国际检疫传染病的病原—O1群霍乱弧菌;1株是非O1/非O139群霍乱弧菌。〔结论〕实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌的检验方面具有快速、灵敏、特异性强等优势,有利于提高霍乱弧菌的检出率。     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立和运用

[目的]建立一种快速检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1非O139群及是否产毒株的方法。[方法]以霍乱弧菌的外膜蛋白基因（ompW）、编码O1群O抗原基因（O1rfb）和编码O139群O抗原基因（O139 rfb）、霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）为目的基因,建立一种多重PCR方法对霍乱弧菌进行检测和分型。[结果]根据相关基因携带情况分为6种型别,并分产毒株和非产毒株。以该法对140株霍乱弧菌分型结果与血清学诊断结果相一致,而其它弧菌和肠杆菌等均未检出相关基因。[结论]该方法快速、特异,可应用于霍乱弧菌的检测和分型。     

淮南市O139霍乱疫情3种快速检测方法的应用比较及菌株相似性分析

目的通过建立霍乱弧菌的快速检测方法,提高霍乱疫情应急检测的速度和检出率,溯源可疑的传染源。方法将细菌分离鉴定,实时荧光PCR快速检测,胶体金免疫层析快速试纸法同时用于检测霍乱疫情处置期间所采集的患者水样便、外环境水质、食品及水产品,并对其结果进行比较分析;将分离到的O139霍乱弧菌进行脉冲场凝胶(PFGE)电泳分型分析。结果 3种检测方法中实时荧光PCR快速检测和胶体金免疫层析快速试纸法阳性率较高,常规细菌分离鉴定阳性率较低,3种方法各有优势及缺点;PFGE分子分型分析提示本次O139霍乱疫情传染源为水产市场中甲鱼带菌,污染病人食用食物所致。结论荧光PCR快速检测和胶体金免疫层析快速试纸法是菌株分离培养方法的有效补充;PFGE对不同来源的霍乱弧菌遗传同源相关性分析有较好的分辨能力。     

徐州市水产品中霍乱弧菌检索方法的研究

目的:改进水产品中霍乱弧菌检索方法,提高检出率,利与外环境中霍乱弧菌的研究。方法:常规培养法、常规培养改良法、荧光定量PCR与快速胶体金筛查方法。结果:64份水产品用常规检测方法未检出霍乱弧菌;常规培养改良法、荧光定量PCR与快速胶体金筛查方法结合常规改良方法分别从64份水产品中检出4株霍乱弧菌(检出率为6.25%),2株为小川型霍乱弧菌,2株为稻叶型霍乱弧菌;荧光定量PCR筛查出8份O1群霍乱弧菌阳性(检出率为12.50%)、快速胶体金筛查出10份O1群霍乱弧菌阳性(检出率为15.63%),荧光定量PCR和快速胶体金阳性标本均经改良培养法检测,在相同的样品中也分离出上述的4株霍乱弧菌。结论:使用荧光定量PCR或快速胶体金筛检与常规培养改良法相结合,可以提高检出率,检测效率,并获得病原菌,利于对病原菌的进一步分析追踪研究。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测中的应用

目的 建立一种能够检测O1群和O139群霍乱弧菌的套式聚合酶链反应方法,并应用于外环境水体标本的监测.方法 根据GenBank发表的O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的序列,运用DNAStar Primer Select软件各自设计6条引物,检测不同引物组合的特异性,建立双重套式PCR方法同时检测O1群和O139群霍乱弧菌;并对该方法进行敏感度、特异度、重复性及现场评价.通过比较套式PCR与常规PCR的DNA检出下限分析该方法的敏感度;对32份套式PCR阳性的水体样本(O1群11份,O139群21份)进行重复性评价,挑选部分阳性扩增产物进行测序,分析其与相应基因序列的一致性.结果 建立的检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重套式PCR体系,根据其扩增的片段大小能够区分O1群和O139群霍乱弧菌,而对其他弧菌DNA样品都未见特异性扩增;敏感度比常规PCR高15 000倍,且在多引物或者多模板共存于一个反应管的试验条件下,不会对敏感度产生干扰;32份套式PCR阳性的水样标本,经2次或3次套式PCR试验,结果显示该体系具有较好的重复性和一致性,阴性水样均无任何扩增产物,说明所用引物的特异性较好;序列分析表明扩增产物仅同霍乱弧菌相应的基因序列有100%的一致性.结论 本检测相应霍乱弧菌的双重套式PCR方法,具有灵敏、特异、快速、适合基层实验室的特点,可用于监测外环境水体中霍乱弧菌的存在及消长情况.     

湖南省O139群霍乱流行因素和快速评估研究

目的了解湖南省O139群霍乱的流行特点,分析流行因素,探索快速有效的监测评估方法和预防控制措施,为制定科学的防控策略提供依据。方法采用回顾性队列研究、生态学研究和现场流行病学调查研究湖南省O139霍乱的流行特点和高发区的流行因素;评估农村集体聚餐卫生指导和管理预防控制措施的效果。分别采用膜免疫层析法和常规细菌分离培养法对腹泻病人及霍乱病人的密切接触者粪便标本进行O139霍乱弧菌检测,以后者为金标准,计算膜免疫层析法的灵敏度和特异度。结果湖南省1997-2009年共发生48起O139霍乱疫情,报告病例103例,带菌者119例,死亡2例,病死率为1.94%。在局部地区有集中发生趋势。2002-2009年常规监测腹泻病人阳性率为2.47/万,水产品样阳性率为0.57%,疫点监测检测人群阳性率为1.18%,外环境阳性率为3.44%;非疫点地区水体环境中未检测到霍乱弧菌。48起疫情中暴发16起,散发32起,28起疫情与农村集体聚餐有关。2003年9起暴发疫情中参与聚餐人员的O139霍乱弧菌感染率为5.46%,食用聚餐剩菜人员的感染率为9.23%,未食用聚餐食物人员的感染率为0,病人和带菌者分离到的O139霍乱弧菌和甲鱼中菌株的PFGE图谱相同。高发区农村聚餐中使用甲鱼和食品制作生熟不分的比率、人均甲鱼消耗量、甲鱼中O139霍乱弧菌检出率均高于低发区。高发区采取农村集体聚餐卫生指导和管理措施后,农村厨师和就餐人群的卫生习惯改善,未再发现疫情。膜免疫层析法检测病例粪便标本中灵敏度为100%,特异度为95.20%,45份实验室霍乱弧菌培养阳性的甲鱼和外环境标本经二次增菌培养,试纸条检测结果为阴性。结论湖南省1997-2009年的O139霍乱疫情呈低流行水平;O139霍乱疫情的发生主要跟食用被霍乱弧菌污染的水产品特别是甲鱼有关,以农村集体聚餐卫生指导和管理为主的综合性预防控制措施是预防O139霍乱疫情发生的有效措施;膜免疫层析法可适用于各医疗机构的腹泻病门诊患者的快速筛查和评估。     

荧光定量PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O104

目的建立针对肠出血性大肠杆菌O104的荧光定量PCR快速检测方法。方法针对O104的wzx保守基因,设计特异性引物和探针,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外34株肠道致病菌评价检测方法的特异性;建立了肠出血性大肠杆菌O104感染食品的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了荧光定量PCR快速检测肠出血性大肠杆菌O104的方法。每次检测最低限为12.0copies,特异性为100%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中具有应用前景。     

微量板培养法在O139群霍乱疫情中的应用与比较

目的：通过采用霍乱弧菌常规培养法与微量板培养法,对一起O139群霍乱疫情现场疫源标本进行比对检测研究,以探讨微板法替代常规法的可能性。方法：用霍乱弧菌常规培养法口与霍乱弧菌微量板培养法心,对某地O139群霍乱疫情现场采集的442份疫源检索样品,同时进行病原学检测,对比观察检测结果。结果：两种方法同时检测442份样品,共检出O139群霍乱弧菌18株,其中常规法检出16株,微板法多检出2株为18株。阳性检出率分别为3．62％和4．07％,阳性符合率为88．89％,检出率之间差别无统计学意义。结果显示微板法稍好于常规法,并且微板法还具有以下优点：1）灵敏度高;2）抗原凝集性好;3）培养板体积小、培养基量少（每孔仅1ml）、容量大（每板可做24份样品）;4）操作简便,不需要特殊设备;5）微量板使用后,经消毒清洗可回收再利用,节约成本,在工作量大时,其实用、简便的优点更为突出。结论：微板法可以用于霍乱弧菌病原检测,可靠性较高,且检测霍乱的特异性和敏感性已达到卫生部《霍乱防治手册》的要求。     

利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立

〔目的〕建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法。〔方法〕利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立单增李斯特菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合标准曲线进行定量检测;在牛奶、橙汁、果冻等即食食品样品中添加单增李斯特菌模拟污染样品,评价该方法对半固体、液体等即食食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。〔结果〕该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线性范围3.5×105～3.5×108cfu/ml,回收率在99%～101.7%之间。〔结论〕建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地对样品中的单增李斯特菌进行定性、定量检测。     

Changing epidemiology of cholera due to Vibrio cholerae O1 and O139 Bengal in Dhaka, Bangladesh.

At the International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh (ICDDR, B) Dhaka we studied the trends in cholera for the period January 1992 to May 1995. Vibrio cholerae O139 Bengal emerged as a second aetiologic agent of cholera in Dhaka in January 1993. In 1993, the majority of cholera cases was due to V. cholerae O139, with V. cholerae O1 accounting for a small proportion of cases. During the latter part of the study period (Jan 1994-May 1995), V. cholerae O1 re-emerged as the predominant cholera strain. The predominant age group affected in endemic cholera due to V. cholerae O1 was children 2-9 years old, and the organism was isolated from more females than from males at all ages. In contrast, cholera due to V. cholerae O139 caused disease mostly in adults 15 years and older, which indicated that this organism was new in this population. As with V. cholerae O1, V. cholerae O139 was isolated from more females than males. The initial rapid emergence and predominance of V. cholerae O139 was considered possibly to herald the start of the eighth pandemic of cholera. However, just after a year, the prevalence of V. cholerae O139 decreased dramatically with V. cholerae O1 resuming the role of the dominant cholera strain. The factor(s) contributing to the dramatic decline in prevalence of V. cholerae O139 is not well understood.     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

西方马脑炎病毒抗体快速检测试纸条的研制

目的研制一种快速检测西方马脑炎病毒（WEEV）抗体的试纸条。方法利用胶体金标记和免疫层析技术,用25 nm胶体金标记葡萄球菌A蛋白,并用硝酸纤维膜包被WEEV抗原及羊抗兔IgG作为检测带和质控带,研制出WEEV抗体快速检测试纸条。对该试纸条的敏感性、特异性和稳定性做出评价,并拟合检测曲线进行半定量检测。在健康人血清、兔血清和鼠血清中添加WEEV抗体模拟污染样品,评价该方法的检测能力。结果该试纸条可在20 min内完成定性和半定量检测,灵敏度为120 ng/ml,模拟样品的检测灵敏度也相同。线性范围120～1200 ng/ml。对发病症状相似以及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存1个月,检测结果不变。结论该试纸条具有快速、简便、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。