辐照后辐射敏感启动子CArG调控HSVtk基因对肺癌细胞的杀伤效应

放射-基因治疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因相耦联，在肿瘤受照射时诱导治疗基因仅在肿瘤内表达，以提高治疗效率。是肿瘤治疗的一种新策略。Egr-1属即刻早期应答基因家族成员之一，是编码533个氨基酸的核酸蛋白转录因子，含6个高度保守的CC（A／T）。GG结构域，又称为cA以元件。据报道CArG元件比天然的Egr-1基因射线应答性更强。本研究为了构建包含CArG元件和增强的绿色荧光蛋白（EGFP）或HSVtk基因的载体，观察射线照射时CArG元件诱导EGFP在SPCA1和A549肺癌细胞株中的表达变化；将pDNA．CArG．HSVtk质粒短暂结逝SPCA1和AS49细胞株，照射后加入GCV，     

乏氧/辐射双启动子系统调控的自杀基因放射治疗研究进展

基因—放射治疗是近年来国际上肿瘤治疗的一个新策略,但由于实体瘤常处于缺氧状态而对放射敏感性低,影响辐射调控序列的转录活性,因此该疗法目前尚未达到理想效果。在治疗基因上游引入乏氧启动子可克服肿瘤乏氧对辐射调控序列转录活性的影响,提高对肿瘤的杀伤效果。全文对辐射诱导、乏氧诱导以及乏氧/辐射双诱导启动子联合自杀基因放射治疗的研究现状、目前存在问题与前景进行综述。     

硒对乏氧肝癌细胞生长的抑制作用

作者研究氧含量对硒抑制人肝癌细胞生长的影响，结果表明：在富氧及乏氧培养条件下，１ｐｐｍ亚硒酸钠对原代及建株培养的人肝癌细胞生长、增殖均有显著的抑制效应（Ｐ＜０．０５）；而对人非癌肝细胞的生长无影响（Ｐ＞０．０５）。提示硒对乏氧肝癌细胞生长也具有抑制作用，硒制剂作为乏氧肿瘤细胞杀伤剂在抗癌、抗癌中具有强大潜力与应用前景；以硒进行肿瘤化学防治是安全可行的，而选择合适的硒服用剂量则是关键。     

hNIS/TK基因共转染介导131I/GCV对肝癌细胞株的毒性作用

背景与目的:与传统的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)肿瘤自杀系统相比,人钠/碘同向转运体(human sodium-iodide symporter,hNIS)是近年来发现的新型治疗基因.然而,两者的疗效尚需进一步提高.本研究旨在探索hNIS介导的放射性核素体系与HSV-TK/GCV自杀基因体系对肝癌细胞的联合毒性作用.方法:构建EF1-a启动子调控下的hNIS的表达载体与CMV启动子调控下的GFP和HSV-TK共表达载体,慢病毒包装后转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察重组肿瘤细胞HepG2/NTG荧光蛋白的表达;采用RT-PCR技术进一步检测目的基因hNIS和HSV-TK的表达情况;MTT检测GCV对HepG2/NTG的杀伤作用;摄碘试验及流出试验评价HepG2/NTG对碘的摄取及滞留情况;最后通过克隆形成实验评价GCV和131I对HepG2/NTG的单独及联合杀伤作用.结果:RT-PCR技术、荧光显像证实hNIS、GFP和HSV-TK基因在肝癌细胞中成功表达;与对照组相比,HepG2/NTG的摄碘高出76倍,20 min摄碘率最高,其后表现出碘外流,有效半衰期不到10 min,同时这种碘摄取能被NaClO4特异性抑制.GCV或131I对HepG2/NTG的毒性作用呈现剂量依赖性:50μg/mL GCV作用72 h后,实验组细胞的存活率仅为(33.98±2.71)%;放射性浓度为7.4MBq/mL的131I处理7 h后,细胞的存活率仅为(41.17±0.72)%;GCV和131I联合作用后,细胞的存活率仅为(8.55±1.22)%,较单一药物作用细胞存活率下降了6倍.结论:131I/GCV对重组肝癌细胞产生显著的毒性作用,提示慢病毒介导hNIS/TK基因共转染介导肿瘤的放射化学治疗是可行的.     

蜂毒素基因重组腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

目的：构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白（AFP）启动子（rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法：人工合成蜂毒素基因，置于rAFP之后，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中，转染人胚肾293细胞进行腺病毒包装；采用MTT法测定蜂毒素基因转染对AFP阳性，阴性肝癌细胞及正常肝细胞增殖的影响。结果：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTT实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP阳性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用。结论：表达rAFP驱动的蜂毒素基因的重组腺病毒在体外可特异性地杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

分泌mRANTES趋化因子的小鼠肝癌细胞的建立及其体内致瘤性的初步研究

目的：建立分泌mRNATES的小鼠肝癌细胞，并观察其体内致瘤性。方法：mRNATES cDNA被克隆入pBabe puro逆转录病毒载体，构建的重组逆转录病毒载体pBabe puro mRNATES转染包装细胞，嘌呤酶素抗性细胞培养上清感染小鼠肝癌细胞系Hepal-6，免疫组化检测Hepal-6、Hepal-6 mRNATES的mRNATES蛋白的表达。绘制Hepal-6 mRNATES与Hepal-6的生长曲线观察细胞的生长。琼脂糖凝胶打孔法体外观察Hepal-6 mRNATES分泌蛋白对小鼠脾细胞的趋化作用。观察Hepal-6 mRNATES体内致瘤性。结果：构建了重组逆转录病毒载体pBabe puro mRNATES,Hepal-6不表达mRNATES,Hepal-6 mRNATES表达mRNATES蛋白。Hepal-6 mRNATES与Hepal-6的生长曲线基本一样。Hepal-6 mRNATES分泌了对小鼠脾细胞有趋化作用的分子。Hepal-6 mRNATES体内致瘤性降低。结论：Hepal-6 mRNATES能产生mRNATES,mRANTES不改变细胞体外生长状况，Hepal-6 mRNATES产生的mRNATES有趋化活性，mRNATES能使Hepal-6 mRNATES致瘤性降低。     

反义端粒酶基因表达对肝癌细胞生长抑制的研究

目的：观察端粒酶基因hTRT反义表达对癌细胞生物学行为的影响,探讨人端粒酶逆转录酶反义基因治疗对肝癌细胞恶性表型的逆转作用.方法：含620bp端粒酶反义hTRT基因的PBSTRT质粒用Sal Ⅰ、BamH Ⅰ酶切后,插入真核表达载体pCDNA3 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点,构建成含反义hTRT基因的真核表达重组子.反义hTRT基因转染肝癌细胞株HepG1-6,观察其对肿瘤细胞生长的影响.结果：成功构建hTRT反义真核表达载体,并导入肝癌细胞株HepG1-6中,获表达hTRT反义基因的细胞系（HepG1-6/pCDNA3-反义hTRT）,该细胞系出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,G0/G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,而HepG1-6/pCDNA3细胞则无明显变化.结论：反义hTRT基因治疗可以明显抑制HepG1-6细胞的增殖,部分细胞受阻于G1期,提示hTRT基因可以作为治疗肿瘤的靶基因.     

p53p21双基因转染对肝癌细胞生长的抑制作用研究

 目的　研究 p5 3和 p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果。 方法　通过磷酸钙 -DNA共沉淀法将p5 3和 p2 1双基因真核共表达载体及单基因表达载体引入肝癌细胞SMMC 772 1,用直接镜检 ,DNAladder检测法和四甲基偶氮唑 (MTT)法等研究细胞生长情况。结果　转染外源 p5 3p2 1双基因的肝癌细胞SMMC 772 1与未转染及单基因转染的肝癌细胞SMMC 772 1相比 ,其增殖速度显著下降。结论　p5 3和p2 1双基因对肝癌细胞的联合基因治疗效果比较明显 ,对肝癌基因治疗的进一步研究具有指导意义。     

5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635对肝癌细胞的抑制作用

目的:研究5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在体外对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的特异性杀伤作用。方法:将SG600载体中5型腺病毒(Ad5)纤毛蛋白的knob和shaft结构域替换为35型腺病毒(Ad35)纤毛蛋白的相应结构域,构建成5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635。流式细胞术检测5/35嵌合型腺病毒Ad5/35-EGFP对HepG2和SMMC-7721细胞的感染效率,体外病毒增殖实验观察溶瘤腺病毒SG635的增殖能力,Western blotting检测SG635感染后肝癌细胞中E1A蛋白的表达,CCK-8实验检测SG635对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用。结果:在肝癌HepG2和SMMC-7721细胞中,Ad5/35-EGFP的感染效率明显强于5型腺病毒Ad5-EGFP;5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在HepG2和SMMC-7721细胞中72 h的增殖倍数高于5型溶瘤腺病毒SG600(15 848.93vs6 309.57,6 309.57vs5 011.87,均P<0.01),而在人正常成纤维细胞BJ中几乎不增殖。SG635感染后,HepG2和SMMC-7721细胞中E1A蛋白表达高于SG600感染,在BJ中则无E1A表达。在一定MOI范围内,SG635对于HepG2细胞和SMMC-7721细胞的杀伤作用逐渐增强,且杀伤率明显强于SG600(MOI为1时,90%vs60%;MOI为10时,90%vs50%),对BJ无杀伤作用。结论:5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635能够高效感染并特异性杀伤肝癌细胞,具有较好的靶向性和安全性。     

VEGF反义RNA对人食管癌细胞抑制作用的研究

目的: 研究血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对人食管癌细胞的抑制作用,探讨以VEGF反义RNA进行食管癌基因治疗的可行性.方法: 采用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染入食管癌细胞TE-1;用MTT法检测细胞增殖情况;用免疫组化法检测VEGF蛋白表达;原位杂交和RT-PCR技术检测VEGFmRNA的表达.流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布.结果: 被反义VEGFcDNA质粒转染的食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞的VEGFmRNA及蛋白表达水平降低,但细胞生长速率无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠后,形成肿瘤的时间明显延长,肿瘤的体积和重量明显减小.结论: VEGF反义RNA可抑制食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内的肿瘤生长.该表达体系为食管癌基因治疗的进一步研究奠定了基础.     

VEGF反义RNA 抑制裸鼠体内食管癌细胞生长的实验研究

 目的 探讨VEGF反义RNA对食管癌细胞在裸鼠体内生长的影响。方法 观察转染VEGF反义RNA的食管癌细胞TE-1在裸鼠体内成瘤性；应用免疫组化法、RT—PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白及mRNA表达和MVD；用流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡情况。结果 转染VEGF反义RNA的TE-1细胞在裸鼠体内肿瘤形成的潜伏期明显延长，所形成肿瘤的重量和体积小于对照组及空载体组。肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达降低，MVD降低；肿瘤细胞发生明显的凋亡形态学改变；G0／G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，细胞增殖能力降低。结论 VEGF反义RNA能抑制裸鼠体内TE-1细胞的生长，减少肿瘤内血管的生成，增加细胞凋亡；为食管癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的：构建表达人环氧化酶－2（cyclooxygenase-2,cox-2)反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞生长的影响。方法：把人cox-2基因的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码cox-2反义RNA的重组腺病毒－Ad-AShcox-2,PCR鉴定为阳性克隆并大量扩增,转染食管癌细胞EC9706,用生长细胞计数,3H－TdR掺入及免疫细胞化学的方法,研究对食管癌细胞生长,cox-2表达,DNA合成的影响,结果：成功构建编码cox-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,病毒感染EC9706后,cox-2表达降低,3H－TdR掺入量减少,与对照组比较P＜0．001,同时发现食管癌细胞的生长受抑制,结论：减少cox-2的表达可能是治疗食管癌的一种新途径。     

反义血管内皮生长因子对食管癌细胞体外放射增敏作用

[目的]研究TE-1细胞转染VEGF反义寡核苷酸，观察转染后肿瘤细胞VEGF表达情况及其对放射敏感性的影响。[方法]将反义VEGF寡核苷酸经Lipofectamine^TM2000介导转染TE-1细胞；并经γ线照射。采用MTT法检测细胞生长状况，RT-PCR、Western blotting检测细胞照射前后VEGF基因的表达，流式细胞术检测细胞周期分布情况和凋亡率；克隆形成实验反映转染后细胞放射敏感性的变化。[结果]将反义VEGF寡核苷酸成功地转染人食管癌TE-1细胞中，VEGF表达水平明显降低，体外增殖反应无明显差异，细胞周期分布情况相似．未见明显凋亡发生。不同剂量照射后增殖情况无统计学差异；反义组细胞凋亡率略有上升．转染反义组细胞较未转染组细胞放射敏感性增加。[结论]转染反义VEGF寡核苷酸可抑制食管癌TE-1细胞VEGF表达，联合放射治疗，对TE-1细胞增殖无明显作用，而其放射敏感性有增强作用。     

表皮生长因子受体反义RNA抑制胶质瘤细胞生长增殖的体外试验

目的：研究表皮生长因子受体基因对于胶质瘤发生发展的作用，探索以ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ进行反义基因治疗胶质瘤的可行性。方法：将含ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的质粒通过脂质体介导转入Ｃ６恶性胶质瘤细胞，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定外源基因整合情况，ＭＴＴ法测定细胞存活率，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、细胞原位ｍＲＮＡ杂交及ＥＧＦＲ免疫组化染色检测ＥＧＦＲｍＲＮＡ及蛋白表达，核仁组成区相关嗜银蛋白染色（ＡｇＮＯＲ计数）检测细胞增殖活性。结果：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明外源性反义ＥＧＦＲ基因（互补于ＥＧＦＲ基因全长及３端部分序列）分别在Ｃ６细胞中整合（分别命名为Ｃ－ｐＲ１和Ｃ－ｐＲ３），通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、原位杂交及细胞免疫组织化学检测均显示转染ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的Ｃ６细胞比转染前ＥＧＦＲｍＲＮＡ水平及ＥＧＦＲ蛋白水平有不同程度的降低。表达高水平反义ＲＮＡ的克隆在培养状态下细胞增殖活性较对照组有明显下降。结论：ＥＧＦＲ在恶性胶质瘤细胞的发生发展过程中起十分关键的作用，ＥＧＦＲ有可能成为基因治疗恶性胶质瘤的优选靶的之一。     

血管表皮生长因子对大肠癌细胞生长的影响机制研究

目的 探讨VEGF对大肠癌细胞生长的影响机制研究.方法 采用基因芯片方法,筛选大肠癌的相关因子.采用免疫组化方法检测大肠癌组织、癌旁组织和正常组织中VEGF的表达.采用免疫荧光方法检测三种组织内淋巴管和血管中VEGF的表达.结果 基因芯片筛选结果显示VEGF在大肠癌组织中呈高表达.免疫组化结果显示22例大肠癌组织中VEGF呈高表达,与正常组织比较,具有统计学意义,P＜0.05.免疫荧光检测结果显示在癌组织中呈高表达VEGF时其淋巴管和血管内均增高(相比于正常组时),且有统计学差异,(分别为P＜0.001和P＜0.05),在癌旁组织中VEGF呈低表达(相比于癌组织)时相对癌组织,淋巴管和血管内均降低,且有统计学差异(分别为P＜0.001和P＜0.05).结论 VEGF可以通过调节淋巴内皮细胞进行促进大肠癌细胞的生长.     

血管内皮生长因子在食管癌组织中的表达及其临床意义研究

 目的 探讨食管癌组织中VEGF的表达水平与食管癌生物学特性的关系. 方法 应用免疫组化法分析人食管癌组织中VEGF的表达和微血管密度;应用RT-PCR法检测食管癌组织及人食管癌细胞株VEGFmRNA的表达. 结果 食管癌组织的VEGF阳性表达率为70.9%,VEGF在肿瘤组织的表达水平明显高于癌旁组织,其表达水平与肿瘤的病理学分级、肿瘤的浸润深度及淋巴结转移等行为有关.食管癌组织中微血管分布不均,血管密集区主要集中在癌灶边缘;MVD与肿瘤的分化程度和淋巴结转移相关;MVD与VEGF的表达之间存在正相关关系.食管癌组织的VEGFmRNA表达比癌旁组织增高,以VEGF189、VEGF165和VEGF121三种亚型为主. 结论 VEGF在食管癌组织中呈高表达状态,该现象与肿瘤的恶性程度、转移情况及微血管形成能力相关.     

Silencing of PDK1 Gene Expression by RNA Interference Suppresses Growth of Esophageal Cancer

The current study was conducted to explore the inhibitory effects of a small interfering RNA (siRNA) on3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) expression in esophageal cancer 9706 (EC9706) cells andthe influence on their biological behavior. After transfection of a synthesized PDK1 siRNA, PDK1 mRNA andprotein expression and the phosphorylation level of the downstream Akt protein were assessed using RT-PCRand Western blot analysis. Proliferation, apoptosis, cell invasion and in vivo tumor formation capacity werealso investigated using MTT, flow cytometry, Transwell invasion trials, and nude mouse tumor transplantion,respectively. PDK1 siRNA effectively suppressed PDK1 mRNA and protein expression, and down-regulated thephosphorylation level of the Akt protein in the EC9706 cells (P < 0.05). It also inhibited cell proliferation andinvasion, and promoted apoptosis; such effects were particularly obvious at 48 h and 72 h after transfection (P< 0.05). Growth of transplanted tumors was inhibited in nude mice, with decreased PDK1 expression in tumortissues. PDK1 may be closely correlated with proliferation, apoptosis and invasion of esophageal cancer cellsand thus may serve as an effective target for gene therapy.     

反义cDNA对放射线诱导食管癌细胞VEGF高表达的抑制作用

[目的]探讨反义VEGFcDNA对放射线诱导人食管癌细胞VEGF高表达的抑制作用,为食管癌放疗与反义VEGF联合治疗提供依据。[方法]阳离子脂质体作为载体,用反义VEGFcDNA质粒转染人食管癌细胞TE-1;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、原位杂交和流式细胞术检测转染后癌细胞;γ线照射转染、非转染食管癌细胞TE-1,采用免疫组化、ELISA与RT-PCR法分别观察反义VEGFcDNA对放射线诱导的食管癌细胞TE-1VEGF表达的作用。[结果]转染反义VEGFcDNA的食管癌细胞有外源性反义VEGFcDNA的整合及表达,癌细胞生长速率无明显减慢,凋亡现象并不明显。转染细胞较非转染的食管癌细胞TE-1相比,照射后细胞表达VEGFmRNA及蛋白的水平均明显降低。[结论]以抗VEGF表达为基础的抗血管生成治疗有可能成为食管癌放射治疗的有效辅助手段。反义VEGFcDNA对放射线诱导的人食管癌细胞VEGF高表达有明显抑制作用。     

125I偶联VEGF反义寡核苷酸对人膀胱癌VEGF的抑制作用研究

目的观察125I偶联VEGF反义寡核苷酸(125I-ASODN)对膀胱癌细胞VEGF表达的抑制情况.方法采用免疫组化法观察125I-ASODN对膀胱癌细胞VEGF表达的影响,并观察条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果免疫组化结果显示对照组VEGF阳性细胞数为平均89.1/100个细胞,125I-Na处理组为90.3/100个细胞,ASODN组为10.3/100个细胞,125I-ASODN组为4.3/100个细胞,125I-ASODN组和ASODN组与对照组及125I-Na组比较,差异有显著性意义(P<0.05);对照组、125I-Na处理组、ASODN组、125I-ASODN组D值分别为0.398±0.031,0.387±0.010,0.298±0.013和0.148±0.011,125I-ASODN组和ASODN组D值与对照组及125I-Na组比较,差异有非常显著性(P<0.01).结论 125I-ASODN 能够明显抑制膀胱癌细胞的VEGF表达,可作为临床抗血管生成治疗膀胱癌的一种有效方法.