肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

目的 本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性. 方法 本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况. 结果 在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变. 结论 NGS的检测准确性可达到100％.NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景.     

实时荧光定量PCR检测大鼠VEGF mRNA方法的建立及初步应用

目的建立大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）实时荧光定量PCR检测方法,对健康大鼠不同组织中VEGF mRNA水平进行检测分析。方法跨内含子设计引物和TaqMan探针,扩增片段TA克隆入pGEM-T载体,制成标准品,分析其特异性、灵敏性和重复性;提取健康大鼠不同部位组织（肺、心、肝脏、肾脏、脑、胃、肠和颌下腺）总RNA,分析其VEGF mRNA表达水平。结果测序及电泳条带证实PCR反应的特异性,批内CV为2.0%～6.7%,批间CV值为3.5%～10.6%,r〉0.99;肺组织中VEGF mRNA表达最高,与其他任意组相比差异均具有统计学意义（P〈0.05）,其它各组织间差异无统计学意义。结论本研究成功建立了检测大鼠VEGF mRNA的实时荧光定量PCR方法,具有高灵敏、高特异、高重复性的特点;健康大鼠不同部位组织中VEGF mRNA的表达水平分析为以后研究疾病大鼠模型表达水平奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测RAGE mRNA方法的建立及初步应用

目的 建立实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测人晚期糖基化终末产物受体(RAGE)mRNA的方法并研究其在食管癌组织中的表达.方法 根据Genebank提供的序列在RAGE基因外显子5和6之间设计引物,应用SYBR Green Ⅰ荧光染料,建立检测RAGE mRNA的RTFQ-PCR方法,并对其线性、特异性、灵敏度及重复性进行评价;根据标准曲线计算出食管癌及配对远端正常组织中RAGE mRNA含量,并以RAGE mRNA和18S rRNA含量的比值作为评价RAGE mRNA表达水平指标.结果 线性范围为5.0×103～5.0×109copies/ml,相关系数为-0.98,批内变异系数(CV)为0.63%～8.71%,批间CV为1.52%～12.38%.食管癌及配对远端正常组织RAGE mRNA与18S rRNA浓度的对数比值(-x±s)分别为0.638±0.068和0.334±0.329(P＜0.005),提示食管癌组织RAGE表达上调.结论 RTFQ-PCR检测RAGE mRNA的方法具有灵敏、特异、重复性好等优点,RAGE mRNA表达水平与食管癌存在一定相关性.     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种用于肝癌早期诊断和监测的血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法 采用Trizol法提取肝癌患者血清中总RNA,以肝癌发生具有代表性的miRNA-125a基因为检测序列,分别设计逆转录引物、扩增引物和Taqman探针; 构建和制备miRNA-125a重组质粒标准品,建立血清miRNA-125a Taqman 实时荧光定量PCR检测方法。结果 成功构建了miRNA-125a重组质粒载体,制备了miRNA-125a重组质粒标准品,建立了血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR扩增体系。经实验验证,所设计引物具有较好的特异性,引物的最低检测限为78.125 copies/μl; 对17例肝癌患者血清miRNA-125a的检测结果在(1.45×10²～3.52×10⁵)copies/μl之间。结论 血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立,为原发性肝癌早期诊断和监测提供一种新的分子诊断定量方法。     

实时荧光定量PCR快速检测BCR-ABL融合基因激酶区M244V突变方法的建立

本研究建立一种敏感性好、特异性高的BCR-ABL融合基因M244V突变的检测方法。设计突变点特异性引物,优化实时荧光定量PCR反应体系和条件,建立检测BCR-ABL融合基因M244V点突变的定量PCR方法。结果表明,成功构建了M244V突变及野生的重组质粒标准品和M244V点突变的实时荧光定量PCR方法;验证结果表明该法具有较好敏感性、特异性和准确性。结论：BCR-ABL融合基因M244V突变的实时荧光定量PCR检测方法可用于临床CML患者M244V突变的检查。     

建立一种高灵敏的HBV核酸定量检测方法

目的 建立一种高灵敏度的TaqMan实时荧光PCR法用于HBV核酸定量检测,并评估其临床性能。方法 针对HBV保守序列设计引物探针,收集来自国内3家医院共计631例样本,利用本文建立的方法进行HBV核酸定量检测,评估其灵敏度、特异性和重复性,并与普遍采用的对照试剂盒进行比较,评价该方法的临床性能。结果 本文建立的HBV核酸定量检测方法对5 IU/mL的HBV血清和血浆样本的检出率均为100%,且对HBV强阳性、弱阳性和临界阳性样本的阳性检出率均为100%;该方法对于可能存在交叉的15种病原体、内源干扰物及外源干扰物均无交叉反应;与对照试剂的检测结果比较基本相同,对于不一致的样本,经过复检均和本文建立的检测方法结果一致。结论 该方法具有较高的灵敏度,稳定性和重复性好,特异性强,具有较高的临床应用价值。     

人类Gfi1基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础.方法 以Gfi1基因为靶基因设计引物.构建携带GficDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品.应用ABI stepone PCR仪对Cfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线.结果 建立了Cfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数y2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%.结论 本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测.     

建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

目的：为 HBV 突变检测建立一种有效、快速、简捷的蝎子实时荧光 PCR 新方法。方法同时用蝎子实时荧光 PCR 新方法和 Sanger 测序法对比：对157例 HBV 患者的血清的 DNA 进行 HBV 基因rtN236T 突变检测,统计其符合率;通过对混有不同比例的 HBV 基因 rtN236T 突变核酸的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度。结果在157例 HBV 患者的血清样本中,蝎子实时荧光PCR 新方法检测到 rtN236T 突变的有69例,而 Sanger 测序法检测的有68例,其符合率为98.6％;蝎子实时荧光PCR 新方法能检测出混有5％突变的样本,其灵敏度达5％,比 Sanger 测序法高。结论蝎子实时荧光 PCR 新方法能有效检测到 HBV 突变,且比 Sanger 测序法更为简单、快速、灵敏度高,适合临床应用。     

高通量检测技术检测乙型肝炎病毒变异的临床意义

目的探讨基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)6位点变异的临床意义。方法对91例乙型肝炎患者采用基因芯片技术,检测HBV 6位点的自然变异。结果91例乙型肝炎患者HBV变异率98.9%(90/91),其中BCP区1762位点变异率最高(61.5%)。重度肝炎和肝硬化中双位点变异显著高于轻中度肝炎(P<0.01)。29例进行过拉米呋啶抗病毒治疗的病例中P区552位点变异率为96.6%(28/29)。结论基因芯片技术检测HBV变异具有高通量、高灵敏等特点,对观察HBV基因突变有很高的临床应用价值。     

Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid

BACKGROUND: The phenotypic expression of disorders caused by point mutations, deletions or depletions within the mitochondrial genome (mtDNA) is heterogeneous. This relates to the phenomena of heteroplasmy, tissue threshold as well as the distribution of mutant DNA among tissues. Hence, the diagnostics of these disorders demands highly specific, sensitive and quantitative methods. METHODS: We have developed an allele-specific quantitative real-time PCR method for the detection of two of the most prevalent disease causing mitochondrial mutations, m.3243A>G (MELAS) and m.8993T>G (NARP). Locked Nucleic Acid (LNA) modified primers were used to obtain high allele specificity. In order to monitor mtDNA depletion a real-time method for mtDNA/nuclear DNA copy number ratio determination was developed. RESULTS: Rapid and sensitive detection and quantification of MELAS and NARP mtDNA alleles were achieved. Heteroplasmy levels as low as 0.01% could be detected, and the mtDNA/nuclear DNA ratio could be determined. CONCLUSIONS: The present method that allows simultaneous determination of heteroplasmy levels and mtDNA/nuclear DNA copy number ratio, will provide a useful tool in molecular diagnostics and in future epidemiological studies of mitochondrial diseases.     

胰腺癌中EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况分析及意义

目的:检测胰腺癌组织EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况,为胰腺癌EGFR靶向治疗研究奠定基础.方法:提取胰腺癌及胰腺良性病变石蜡组织切片中基因组DNA,PCR扩增EGFR 18、19、21外显子片段,KRAS2、3外显子片段,BRAF15外显子片段,采用直接测序法检测其突变状况.结果:32例胰腺癌患者中有24例患者存在KRAS基因突变,10例良性病变组织均未发现突变,两者差异具有统计学意义(x2=14.57,P=1.35× 10-4),其中22例12密码子突变(G12D14例,G12V8例);2例61密码子突变(Q61L).所有检测样本中未见BRAF突变.共3例EGFR突变,其中包括1例19外显子突变(de1746-750),2例21外显子突变(L858R),10例良性病变组织未见突变.结论:在胰腺癌中KRAS基因突变可能为EGFR通路失调的主要原因,其次是EGFR突变,BRAF突变未见.     

Assessment of the clinical application of detecting EGFR,KRAS, PIK3CA and BRAF mutations in patients with non-small cell lung cancer using next-generation sequencing

Background: Next-generation sequencing (NGS) has been widely applied in clinical research, while its application in routine clinical molecular testing requires careful validation. The aim of our study was to assess the clinical usefulness of the NextDaySeq Lung panel on Ion Torrent? PGM in mutation detection of actionable genes in lung cancer.

Methods: The NextDaySeq assay was evaluated by blinded comparisons to Quantitative Real-Time PCR (qPCR) assays with 188 consecutive samples from Chinese patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) to detect mutations in EGFR, KRAS, PIK3CA and BRAF. Discordant variants were further validated by Sanger sequencing and independent qPCR and NGS assays.

Results: Our results showed 93.3% concordance of reportable variants mutually covered in both NGS and qPCR assays, with a clinical sensitivity of 89.9%, specificity of 97.5%. Through the comparison, the NGS assays demonstrated its advantages in offering more clinical relevant information, such as detecting non-hotspot mutations and providing mutation allele frequencies (MAF) and accurate mutation sequences. The analytical sensitivity of NGS to detect mutations with low MAF needs further improvement.

Conclusions: The NextDaySeq Lung panel exhibited good clinical performance, strongly supporting the implementation of the NGS assay in routine clinical use to facilitate therapeutic decision-making for lung cancer patients.     

定量RT—PCR检测穿孔素mRNA方法的建立与临床初步应用

目的　建立检测穿孔素mRNA的定量RT PCR方法。方法　用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量RT PCR方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果　 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道肿瘤患者的穿孔素mRNA水平与正常相比 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ,乳腺肿瘤及白血病患者的穿孔素mRNA水平与正常人相比 ,没有差异。结论　穿孔素mRNA水平的降低可能是肿瘤发生的一个重要原因 ;除穿孔素途径以外 ,还存在别的抗肿瘤的效应机制。     

急性白血病MLL融合基因新检测方法的建立和应用

本研究旨在建立一种快速检测急性白血病中常见MLL融合基因的方法。针对10种最常见的MLL融合基因,首先通过检索文献及数据库,确定已报道的所有融合形式并据此设计引物和探针。其次,以构建的16个阳性质粒和阴性细胞系建立和优化多重实时PCR检测体系。最后,利用所收集的54份白血病标本对该体系进行临床评估,并对检出的阳性标本进行测序验证。结果:该体系可对所有阳性质粒进行有效检测,且灵敏度均可达10个拷贝。在54份标本中,检出MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ELL 4种类型的融合基因,对阳性标本进行测序,测序结果与检测结果一致。结论:本研究建立了一种筛查MLL融合基因的多重实时PCR方法,能够对发生频率约占MLL融合类型90%的10种融合基因进行检测。该体系具有快速、灵敏、特异、可靠的优点,将有助于临床上MLL融合基因阳性患者的诊断和管理。     

MN血型GYPA基因测序方法的建立及应用于汉族人群检测

目的建立适合检测中国汉族人群MN血型GYPA基因的测序技术,用于中国汉族人群MN血型基因的分子遗传背景及遗传多态性的研究。方法根据GenBank的NG-007470基因参照序列,自行设计GYPA基因第1—7外显子共7对引物,以随机选取的55份中国汉族人群标本的DNA为检材,探索最佳反应体系与PCR扩增条件,同时扩增GYPA的第1—7外显子,含括了GYPA基因的全长外显子序列。使用PrismTM ABI3730XL DNA测序仪进行碱基序列分析,以Oligo分析软件分析碱基序列。检测结果的可靠性通过血型血清学、PCR-SSP基因分型方法进行验证。结果应用该方法可以在同一扩增条件下同时扩增GYPA基因的全部外显子,同步检测到GYPA基因共7个外显子的碱基序列,55份标本的基因测序结果与血清学、PCR-SSP基因分型结果完全一致。结论本研究的GYPA基因测序方法准确、可靠,适用于中国汉族人群的GYPA基因测序。     

非小细胞肺癌EGFR和KRAS基因突变和临床病理特征分析

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中表皮生长因子受体(EGFR)和鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)突变状态及其与临床病理特征的关系.方法 回顾性收集2019年1月至2021年6月首都医科大学大兴教学医院183例病理确诊NSCLC患者临床病理资料,采用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测肿瘤组织中EGFR和KRAS基因的突...     

尿胱抑素C检测方法的建立及临床应用

目的 建立尿胱抑素C的检测方法,初步探讨其临床应用价值。方法 采用胶体金免疫比浊法检测尿中胱抑素C,并作方法学评价。同时对40例正常人和135例相关疾病患者检测尿中胱抑素C、α1-微球蛋白（α1-MG）和β2-微球蛋白（β2-MG）,比较3种蛋白在对照组和各疾病组的阳性率。结果 尿胱抑素C检测有较好的检测范围和良好的线性范围,总CV为5．01％,其他蛋白质对试验基本不存在影响。相对于α1-MG和β2-MG而言,尿胱抑素C有较高的灵敏度和特异性,没有明显昼夜节律。结论 尿胱抑素C是肾脏疾病时肾小管功能障碍的敏感指标。