大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响

目的 探讨植物雌激素-大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响。方法 应用MTT比色方法研究大豆异黄酮对人子宫内膜腺上皮细胞增殖的影响。结果 低浓度(0．0005～0．05mg／L)时，随着剂量的增加表现出刺激子宫内膜增殖的作用。高浓度(0．05～5mg／L)时，随着剂量的增加大豆异黄酮刺激子宫内膜增殖的幅度下降。结论 大豆异黄酮能起到促进子宫内膜细胞增殖的作用，从而维持子宫内膜的内分泌功能。     

左旋炔诺孕酮对人子宫内膜细胞体外增殖及细胞间通讯的影响

 【目的】探讨左旋炔诺孕酮对体外培养的人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞增殖、间隙连接细胞间通讯（gap iunction intercellular communication，GJIC）及连接蛋白（connexin，Cx）43、32表达的影响。【方法】采用MTT法观察LNG对人子宫内膜细胞的增殖调节作用，采用划痕染料标记示踪技术，观察左旋炔诺酮（1evonorgestrel，LNG）对原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞及问质细胞GJIC的影响，采用激光共聚焦显微镜扫描技术，观察LNG对Cx43、Cx32表达的影响。【结果】LNG浓度为5×10^-5 mol／L时，对子宫内膜间质和上皮细胞均有抑制生长作用（P〈0．05），体外培养的人子宫内膜问质细胞的GJIC功能较腺上皮细胞强（P〈0．05），LNG可显著提高人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞间荧光黄染料的扩散（P〈0．05）；同种Cx腺上皮细胞表达较间质细胞强（P〈0．05），LNG对两种细胞Cx的表达没有影响（P〉0．05）。【结论】LNG可抑制人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞体外增殖，显著促进细胞GJIC功能，提示其在逆转子宫内膜增殖性病变的阶段扮演重要角色；LNG未影响子宫内膜细胞Cx43、Cx32的表达，提示Cx表达量不能完全反映GJIC功能。     

神经生长因子对子宫腺肌病基质细胞生存率及雌激素受体α表达的影响

目的研究神经生长因子（NGF）对子宫腺肌病患者离体培养在位子宫内膜基质细胞雌激素受体仅表达的影响。方法用10ng／ml、50ng／ml和100ng／ml的神经生长因子分别对体外原代培养人子宫内膜细胞进行干预,用MTT法测定内膜基质细胞生长的增殖情况,用Westen—blotting测定50ng／mlNGF对病例组基质细胞雌激素受体仪表达的变化。结果50ng／ml的NGF可促进子宫内膜基质细胞增殖,细胞存活率为82．61％,比其他浓度NGF显著升高（P〈0．05）;50ng／mlNGF对病例组和对照组不同细胞雌激素受体表达有影响,病例组腺上皮细胞和基质细胞总体均数差异均具有统计学意义（P〈0．01）。结论50ng／ml的NGF可促进子宫腺肌病在位内膜基质细胞增殖及腺上皮细胞和基质细胞雌激素受体仅表达。     

维甲酸对hLECs生长特性的影响

目的探讨维甲酸对传代培养的人晶状体上皮细胞生长特性的影响。方法选取第2～5代hLECs，利用倒置显微镜观察RA对细胞形态的影响；MTT法观察RA对细胞增殖的影响，计算RA对细胞增殖的抑制率；间接免疫荧光法观察RA对整合素β1表达阳性率和波形蛋白形态的影响。结果倒置显微镜下，10^-8～10^-6mol／L组上皮细胞增多，成纤维细胞减少，10^-5mol／L组2种细胞都减少；MTT法显示，10^-7～10^-5mol／L组细胞增殖受抑制，抑制作用呈剂量、时间依赖性（F检验，P〈0．05），抑制率在10．8％～32．0％。10^-6～10^-5mol／L组整合素β1表达明显增高（Х^2检验，P〈0．05），10^-7～10^-5mol/L组波形蛋白在细胞内铺展较均匀。结论RA具有抑制传代细胞增殖的作用，但表现为抑制成纤维细胞和促进上皮细胞二者作用的总和，只是抑制作用远远大于促进作用。     

千层纸素A内皮依赖性舒张大鼠离体血管的作用

目的：研究千层纸素A对离体大鼠胸主动脉的血管舒张作用及其内皮依赖性作用机制。方法：分离wistar大鼠的胸主动脉,采用离体大鼠胸主动脉环张力测定法检测千层纸素A对1Mmol／L去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）或60mmol／L氯化钾预收缩的大鼠离体胸主动脉环的舒张效应,并观察去内皮或用一氧化氮合酶抑制剂N-硝基L-精氨酸甲酯（NG-nitro-Largininemethylester,LNAME）预处理后千层纸素A舒张血管作用的变化。结果：千层纸素A（10、100μmol／L）可以舒张NE（1μmol／L）和氯化钾（60mmol／L）预收缩的内皮完整的离体血管,10、100μmol／L药物浓度组与溶剂对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）;对去内皮血管的舒张作用显著低于内皮完整的血管（P〈0．05,P〈0．01）;终浓度为100μmol／L的L—NAME可以显著降低100μmol／L千层纸素A的舒血管作用,加入L—NAME组-9不加入抑制剂组比较差异有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论：千层纸素A可通过内皮依赖的一氧化氮途径发挥舒张血管的作用。     

H2O2对ECV304细胞Grx mRNA表达的影响

目的通过体外实验，研究H2O2对人脐静脉内皮细胞（ECV304）谷氧还蛋白（Grx）mRNA表达水平的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞（ECV304）；MTT实验观察H2O2对ECV304细胞增殖的影响；在时间相关性研究中，将细胞分为6组，第1组为正常对照组，第2、3、4、5、6组分别给予终浓度100μmol／L H2O2作用5min、10min、30min、60min、120min；在剂量相关性研究中，将细胞分为6组，第1组为正常对照组，第2、3、4、5、6组分别给予终浓度100μmol／L、200μmol／L、300μmol／L、400μmol／L、500μmol／L H2O2作用30min，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，并用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）研究各组细胞Grx mRNA表达水平的差异。结景MTT结果表明，100μmol／L H2O2对细胞增殖无影响，200—500μmol／L H2O2均在不同程度上抑制细胞增殖（P〈0．05）。RT-PCR结果显示，在时间相关性研究中，终浓度100μmol／L H2O2作用10min、30min、60min均能使ECV304细胞中Grx mRNA表达水平增高，30min达到最大值，差异显著（P〈0．05）；剂量相关性研究表明，终浓度100μmol／L H2O2．400μmol／L H2O2作用30min均能使Grx mRNA表达水平增高，差异显著（P〈0．05），其中终浓度300μmol／L H2O2可使Grx mRNA的表达量最高（P〈0．01）。结论H2O2影响人脐静脉内皮细胞Grx mRNA的表达水平。     

氟哌啶醇对离体灌注兔心脏兴奋性的抑制作用

目的：研究氟哌啶醇（hal）对离体兔心脏兴奋性的抑制作用。方法：用Langendorff离体灌注兔心脏模型，观察含hal的K-H灌注液灌注兔心脏时，对离体兔心脏电生理参数的影响。结果：Hal 0．75μmol／L组，1．50μmol／L组与对照组比，HR显著减慢（P〈0．01），心房舒张期阈值（ADT）、心室舒张期阈值（VDT）均显著提高（P〈0．01），心房相对不应期（ARRP）、心房有效不应期（AERP）、心室相对不应期（VRRP）、心室有效不应期（VERP）均显著延长（P〈0．05，P〈O．01）；1．50μmol／L组较0．75μmol／L组HR显著减慢（P〈0．01），ADT、VDT无显著变化，ARRP、AERP、VRRP、VERP均显著延长（P〈0．05，P〈0．01）。结论：hal能直接作用于心脏，具有降低ADT、VDT，呈剂量依赖性减慢HR，延长兔心房、心室不应期的作用。     

游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol／L）软脂酸的DMEM—F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及凋亡相关蛋白caspase8蛋白表达的变化。结果FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0．05）,并可诱导细胞凋亡（P〈0．05）。经FFAs作用后,iNOS及Caspase8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,FFAs可能通过激活肾小管上皮细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,加剧肾小管上皮细胞的凋亡,而caspase8参与了其发生和发展的过程。     

甘肃黄芪异黄酮化合物对血管内皮细胞凋亡的影响

目的 观察甘肃黄芪异黄酮化合物对血管内皮细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,将细胞分为对照组（A组）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（1μmol／L）组（B组）、AngⅡ（1μmol／L）＋毛蕊异黄酮（1μg／mL）组（C组）、AngⅡ（1μmol／L）＋2’-OH-3’,4＇-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖（1μg／mL）组（D组）;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜技术观察细胞的形态;Annexin—V／PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率及凋亡相关基因Fas蛋白的表达。结果 B组与A组比较,B组HUVECs凋亡率、Fas蛋白表达率和平均荧光强度增加（P〈0．001）,激光共聚焦显微镜可观察到典型的凋亡细胞;C组与B组比较,毛蕊异黄酮抑制了AngⅡ的促HUVECs凋亡作用（P〈0．001）,降低了Fas蛋白表达率（P〈0．001）;两种黄芪异黄酮单体毛蕊异黄酮和2＇-OH-3’,4＇-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖的组间比较,HUVECs凋亡率（P=0．195）和Fas蛋白表达率（P=1．000）均无显著性差异。结论 黄芪异黄酮化合物可以抑制AngⅡ所致的体外培养HUVECs的凋亡。     

白藜三醇对人脐静脉内皮细胞增殖及NO表达的影响

目的观察白藜三醇对正常状态下人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HU—VECs）磷酸化蛋白激酶B（P—Akt）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（P-NOS）及一氧化氮（NO）表达的调节作用,探讨白藜三醇对HUVECs增殖的影响及可能机制。方法实验分组：DMEM高糖（〈4．5mg／L）培养基培养组（正常组）、白藜三醇组（分为0．2、1、5、10、20μmol／L5个剂量亚组）、白藜三醇＋LY294002组、LY294002组（阻断剂组）。其中LY294002为磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,P13-K）抑制剂。应用CCK-8法检测细胞增殖情况;Westernblot检测各组细胞内蛋白激酶B（Akt）、P—Akt、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、P-eNOS蛋白的表达;硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO的浓度。结果①白藜三醇组1、5μmol／L2个剂量亚组与正常组相比细胞增殖增加（P〈0．01）,5μmol／L亚组与0．2、10、20μmol／L亚组相比细胞增殖增加（P〈0．01）;白藜三醇20μmol／L对细胞增殖有抑制作用（P〈0．01）。②与对照组比较,白藜三醇组P-Akt（P〈0．01）、P-eNOS（P〈0．05）蛋白表达增加;与白藜三醇组比较,白藜三醇＋LY294002组P-Akt、P-eNOS蛋白表达降低（P〈0．01）。③与对照组比较,白藜三醇组NO表达增加（P〈0．05）;与白藜三醇组比较,白藜三醇＋LY294002组NO表达降低（P〈0．01）。结论白藜三醇可能通过P13-K／Akt／eNOS信号通路诱导正常状态下内皮细胞NO表达的增加,从而促进内皮细胞增殖。     

新型异黄酮及甾体类化合物体外抗癌细胞增殖活性的初步筛选

目的研究改构后的异黄酮及甾体类化合物是否具较好的体外抗细胞增殖的活性.方法采用MTT法,以5,7,4'-三羟基异黄酮(Genistein,GEN)作为对照,研究28个改构后的异黄酮和甾体化合物对Hela细胞、MCF-7细胞的抗增殖作用,并在此基础上,分析其构效关系.结果通过对28种化合物采用MTT的方法对其体外活性进行初筛,初步认为异黄酮类化合物F11、ZF3、ZF4、ZF7以及甾体类化合物ZE2均对Hela细胞、MCF-7细胞增殖有显著的抑制作用,效果均优于Genistein.结论异黄酮和甾体类化合物经过结构改造和修饰,其大部分对Hela细胞、MCF-7细胞的增殖有显著的抑制作用,有进一步研究的潜在价值.     

小鼠子宫内膜细胞的原代培养与鉴定

目的:建立小鼠围着床期子宫内膜细胞的原代培养,并对其进行形态学鉴定。方法:通过挤压法获取小鼠子宫内膜组织,胶原酶Ⅰ消化,过滤法,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,免疫细胞化学染色法对间质细胞(ESC)及上皮细胞(EEC)进行鉴定。结果:EEC和ESC经角蛋白抗体和波形蛋白抗体染色,胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论:成功培养了原代小鼠子宫内膜细胞,方法简便有效,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。     

雌、孕激素对体外培养种植窗期子宫内膜腺上皮细胞降钙素表达的调节

目的 探讨雌、孕激素对体外培养人类子宫内膜腺上皮细胞降钙素（Ｃｔ）表达的影响及其意义。方法　建立子宫内膜 腺上皮细胞体外培养体系．分别用雌二醇（Ｅ２）、孕酮（Ｐ４）刺激细胞２４ｈ、４８ｈ,其浓度分别为１× １０－７、１×１０－８、１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ 和１×１０－６、１×１０－７、１×１０－８ｍｏｌ／Ｌ,利用流式细胞仪对Ｃｔ表达阳性细胞进行检测。结果　性激素影响体外培养的人子宫内膜 上皮细胞Ｃｔ的表达,Ｐ４促进Ｃｔ表达,并呈剂量依赖性,１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ作用２４ｈ,其促进效应最强;而低剂量Ｅ２对Ｃｔ表 达无明显影响,高浓度Ｅ２则抑制其表达。结论　子宫内膜上皮细胞Ｃｔ的表达受性激素调节,在人类胚胎着床过程中起 重要作用。     

NES1在人子宫内膜腺上皮细胞及子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达

目的：研究正常上皮细胞特异性-1基因（normal epithelial cell specific-1,NES1）在人正常子宫内膜腺上皮细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达。方法：原代培养人子宫内膜腺上皮细胞,用免疫荧光定量PCR及Western blot的方法检测NES1在子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞中的表达。结果：成功培养人子宫内膜腺上皮细胞;NES1在正常人子宫内膜腺上皮细胞中表达,表达定位在细胞质。NES1在Ishikawa细胞中表达较在子宫内膜腺上皮细胞中明显降低（P〈0.05）。结论：NES1基因表达缺失可能是子宫内膜癌的发生机制。     

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的 研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的不同影响.方法 取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型.在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能.结果 ①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P＞0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化.结论 异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关.     

大豆异黄酮协同叶酸拮抗神经胶质细胞损伤的研究

目的探讨不同剂量大豆异黄酮单独干预、大豆异黄酮与叶酸联合干预对神经胶质细胞损伤的保护作用,并对其可能的作用机制进行探讨。方法选用24 h龄ICR小鼠,以肝微粒体酶混合物(S9)诱导环磷酰胺制备神经胶质细胞的损伤模型,采用单细胞凝胶电泳技术(彗星试验)和MTT细胞活性试验,观察大豆异黄酮、叶酸及两者联合作用后对神经胶质细胞损伤的拮抗作用。结果彗星试验中,与模型组比较,各干预组神经胶质细胞的彗星细胞拖尾率(P<0.05)和尾长值均明显降低(P<0.01);随着大豆异黄酮浓度的增加,大豆异黄酮单独和联合干预组的彗星细胞拖尾率和尾长值逐渐降低,但两者的差异无统计学意义(P=0.052)。MTT试验中,与模型组相比,各干预组的细胞活性明显增强(P<0.05),随着大豆异黄酮浓度的增加,大豆异黄酮单独或联合干预组的OD492值逐渐升高,尤其是大豆异黄酮和叶酸联合干预比相应的大豆异黄酮单独干预效果明显(P<0.05)。结论大豆异黄酮可以在一定程度上抑制神经胶质细胞损伤和增强细胞的活力,两者联合作用的效果更佳,且存在一定的剂量-反应关系。提示大豆异黄酮和叶酸对神经胶质细胞具有较好的协同作用。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

人离体子宫内膜细胞培养方法的建立

目的：建立分离培养人在位及异位子宫内膜间质及腺上皮细胞的方法，为进一步探讨子宫内膜异位症发生，发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：对36例在位子宫内膜及19例异位内膜随机分为离心分离组及筛网分离组进行体外培养。通过光镜观察及S－P免疫组化染色法，对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：离心分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为61．1％和30％；筛网分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为83．3％和77．8％。结论：采用筛网分离法及离心分离法均能获得纯度较高的间质与上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于揭示子宫内膜异位症的发病机制，为临床治疗提供重要的理论依据。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。