抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体,为建立TRAIL酶联吸附检测方法奠定基础。方法以原核表达系统重组制备的可溶性人sTRAIL作为抗原,利用杂交瘤技术筛选获得抗人TRAIL?mAb杂交瘤细胞株。体内诱生法生产腹水,经间接ELISA方法检测腹水效价,Western?blot鉴定抗体特异性。结果制备获得一株可稳定分泌抗人TRAIL?mAb的杂交瘤细胞株,属IgG2b亚类;腹水效价达1:5×106以上,Western?blot鉴定结果显示可特异性识别人TRAIL,而与TNF-α和Fas-l无明显的交叉反应。结论制备了具有高特异抗原结合特性的TRAIL?mAb。     

抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)M蛋白N端1~43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb。用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株。Westernblot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性,并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAbIg亚类。为分析mAb识别位点,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,以Westernblot初步定位mAb识别位点。结果:获得1株可分泌特异性抗SARS-CoVM蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9),Ig亚类鉴定为IgG2a,轻链为κ型。Westernblot显示其mAb可特异识别SARS-CoVM蛋白N端1~43aa,间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应,其识别位点位于M蛋白N端16~28aa。结论:成功获得1株抗SARS-CoVM蛋白N端1~43aamAb杂交瘤细胞,并初步定位其识别位点。     

抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体制备和鉴定及其应用

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)的单克隆抗体(mAb),并对该Hp mAb进行分析鉴定,建立一种检测患者由于Hp感染而在血清中产生Hp抗体的竞争ELISA检测方法。方法用灭活的Hp免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备Hp mAb。我们采用Hp混合蛋白包括毒素相关蛋白A(CagA)、空泡毒素A(VacA)和尿素酶以及灭活的Hp菌体筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA和Western blot等技术对所获得的Hp mAb进行鉴定。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记所筛选的Hp mAb来建立一个可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结果通过大规模的杂交瘤筛选,我们选择了1株将其命名为C3 Hp mAb,其抗体亚型为IgG2a,腹水效价可达1×107。Western blot法、ELISA和质谱检测结果显示,该C3 Hp mAb能特异地识别Hp的尿素酶B亚单位。用这个C3 Hp mAb,我们建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结论成功获得一种可以特异识别Hp尿素酶B亚单位的mAb,建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。     

抗果蝇ECP蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗果蝇ECP蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:用大肠杆菌表达并纯化的GST-ECP融合蛋白,免疫6~8wk的雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化培养制备杂交瘤细胞系。用间接ELISA及Western blot等方法对mAb的Ig亚类(型)、腹水效价及特异性进行鉴定。结果:获得1株杂交瘤细胞株,命名为8G9。Ig亚类(型)鉴定表明,此株mAb为IgG1(κ型)。腹水mAb的效价为1∶1×105。Western blot分析表明,该株mAb可与果蝇的幼虫、蛹及成虫组织中表达的ECP特异性结合,可特异性的识别ECP抗原的231~300aa区段。结论:获得1株能稳定分泌抗ECP mAb的细胞株,为进一步研究ECP的功能奠定了基础。     

抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2)。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位。结论成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。     

鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用原核表达的鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白(rPla),通过杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(mAb),为相关研究工作奠定基础.方法:大肠杆菌表达的Pla蛋白,包涵体经尿素反复洗涤纯化后免疫BALB/c小鼠,取血清抗体效价高的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,以表达Pla、表达GST、天然提取Pla 3种蛋白为抗原物,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,并结合Western blot对所获取mAb的特异性进行鉴定.结果:经间接ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗天然Pla蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为15B8、14H4、19A4,亚类测定分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ链;腹水经间接ELISA法检测效价可达1:106:Western blot实验证实该3株mAb能特异性识别天然Pla蛋白.结论:成功获得了抗鼠疫耶尔森氏菌天然Pla抗原的特异性mAb,为进一步研究Pla蛋白及研发诊断试剂奠定了基础.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

目的: 制备人核迁移蛋白(hNudC )的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET-28b/hNudC, 表达带有6-His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性.结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(ê) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶ 64和1∶ 32; 腹水mAb的效价分别为1∶ 1×105和1∶ 5×104.mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg-01和人脐带血来源的CD41 巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白.结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础.     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

肝癌候选标志物HCCR单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备肝癌候选标志物HCCR蛋白的单克隆抗体(mAb).方法:重组表达HCCR-1167-360蛋白用于动物免疫,用含有HCCR蛋白抗原表位YLGTRR的重组蛋白(Ep-HCCR)检测血清抗体效价及筛选阳性克隆.通过ELISA、Western blot、免疫荧光和免疫组化方法鉴定制备的HCCR抗体的性质.结果:获得1株分泌HCCR抗体杂交瘤细胞株,通过ELISA方法测定抗体的亲和力常数为5.4×106L/mol;Western blot结果显示,该抗体能特异识别肝癌HepG2细胞中HCCR-1和HCCR-2蛋白;免疫荧光检测显示,HCCR蛋白主要分布在细胞质和细胞膜中;免疫组化检测到肝癌组织中有HCCR蛋白表达但在正常组织中没有.结论:成功制备了1株抗HCCR特异性mAb,为建立基于HCCR的肝癌检测方法奠定了基础.     

抗人HPPCn单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高灵敏度的抗人HPPCn单克隆抗体(mAb),以用于HPPCn的功能研究及其疾病相关性研究。方法:用重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆,获得稳定分泌抗人HPPCn mAb的细胞株。采用间接ELISA、Western blot、Ig亚类快速定性试纸分析法等鉴定抗体的生物学特性;通过细胞免疫荧光实验观察了HPPCn蛋白的细胞定位。通过噬菌体肽库技术分析抗体所识别的抗原表位。结果:得到了1株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,命名为W2-D5。经Ig亚类分析确定,该细胞株分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA检测表明,该抗体检测HPPCn的极限为0.1μg/L;Western blot结果显示,该抗体能特异性识别HPPCn。细胞免疫荧光实验,证实了HPPCn蛋白定位在细胞核。通过肽库筛选及表位分析认为,该抗体识别的表位可能为HPPCn7-13(IHLELRN)。结论:成功地获得了抗人HPPCn的特异性mAb。     

抗11β-羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人11β-羟类固醇脱氢酶1(homo sapiens hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 1,HSD11B1)的单克隆抗体(mAb)并初步鉴定其特性.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系.其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),Western blot结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35 000的蛋白;应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAP XR)进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1.结论:mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1,该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验,为HSD11B1的研究提供了有力的工具.     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

抗KDR胞内区(KDR-CD)单克隆抗体的制备和鉴定

目的:研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区(KDR-CD)的特异性单克隆抗体(mAb).方法:以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞;用间接ELISA法测定其亲和力、亚类,Western blot检测其特异性.结果:获得1株稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株,命名为2B8H2A5;它分泌的抗体亚类为IgG1,к型轻链,而且亲和力强、特异性高.结论:成功获得能分泌抗KDR-CD mAb杂交瘤细胞,为以后将该mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂,使其能进入细胞内与受体KDR-CD特异性结合并阻断血管内皮细胞生长因子强大的生物学功能奠定了重要的基础.     

抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定

目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1亚类,可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域。结论:获得1株可特异性识别CD1dα1结构域的mAb,为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段。     

PCGF1蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达人表观抑制因子Polycomb家族成员PCGF1蛋白片段,并制备其鼠源单克隆抗体(mAb)。方法:应用PCR技术扩增人PCGF1基因编码区部分序列(CDS区第382～567bp的DNA片段)并插入到pET-32a(+)质粒中,在大肠杆菌BL21中进行His-PCGF1-128/189融合蛋白(简写为His-N128/189)的原核表达。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和层析纯化。用所获得的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,分别通过ELISA和Western blot法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定mAb的Ig亚类。取1株杂交瘤细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore公司的mAb纯化试剂盒纯化mAb,用Western blot法检测mAb的效价。结果:表达纯化了重组人His-N128/189蛋白;筛选出2株可稳定分泌特异性抗人PCGF1 mAb的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得高效价(1∶6000)、高特异性的鼠抗人PCGF1 mAb。结论:原核表达的PCGF1片段融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应mAb可特异识别内源性和外源性PCGF1蛋白,可以运用于PCGF1基因功能的研究。     

抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定

目的: 制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术, 制备小鼠源性抗人ILT4 mAb.用间接ELISA法测定腹水mAb的效价.以Western blot测定mAb的抗原结合活性.通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定.结果: 获得7株分泌抗ILT4 mAb的杂交瘤细胞株.ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6, 7株mAb均为IgG1(κ).Western blot结果显示, 3株mAb与人ILT4有良好的结合活性.用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子.结论: 获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb, 为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段.