RNA干扰技术在肝癌治疗领域的应用新进展

在全球范围内,肝癌是第5大常见的恶性肿瘤,也是导致人类死亡的主要因素之一。目前,几乎没有针对肝癌的有效治疗手段。因此,发展一种新手段意义重大。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)作为一种基因沉默技术,能高效且特异地抑制相关基因的表达,为肝癌的基因治疗提供了新的手段和希望。对近几年RNAi技术在肝癌领域的应用进行综述。     

RNAi药物与中药现代化的思考

通过梳理RNA干扰(RNAi)药物的发展历程,分析首个RNAi药物的作用机制,并结合植物药miRNA的研究进展,阐述其给中药现代化带来的启示。认为中药来源的miRNA有可能成为一类新的天然的具有生物活性的RNA干扰药物,需要予以重视和研究。     

靶向VEGF—hTERT基因siRNA表达载体抑骨肉瘤生长的实验研究

目的：观察靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法：构RNA干扰腺病毒载体rA-hTERT和rAd-VEGF,单独和联合转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和VEGF基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后使用siRNA表达载体治疗,观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果：①转染后48h,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约84%,对VEGF基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-VEGF对VEGF基因mRNA的抑制率约82%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-hTERT-VEGF干扰组对hTERT基因表达抑制率约87%,VEGF基因表达抑制率约83%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT-VEGF基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05）。②干扰组转染后l～6d均能促进细胞凋亡,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05）。裸鼠实验中,基因组肿瘤的生长均受到明显抑制,且联合干扰组与单基因组比较有显著性差异（P〈0.05）。对骨肉瘤的肺转移联合干扰组有显著的抑制作用。结论：靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长及转移均有明显的抑制作用。     

siRNA沉默兔bFGF基因表达对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨利用RNAi技术沉默bFGF基因抑制兔血管平滑肌细胞增殖的作用。方法：针对兔bFGF基因的mRNA序列合成siRNA,然后构建携带bFGF—siRNA的质粒载体,将其转染体外培养的VSMC,分别用MTT法、流式细胞术分析细胞增殖率和凋亡率的变化,免疫细胞化学染色观察细胞PCNA的表达变化,同时用RT—PCR检测细胞转染前后bFGF基因表达量的变化。结果：表达bFGF—siRNA的质粒载体转染后VSMC增殖能力减弱,凋亡增加,bFGF的mRNA表达量明显减弱。结论：利用bFGF—siRNA质粒表达载体沉默bFGF基因mRNA能抑制VSMC的增殖。     

BCSG1基因RNAi表达载体的构建与鉴定

目的:构建乳腺癌特异性基因(BCSG1)RNAi重组质粒,并检测其在三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321中对BCSG1基因表达的干扰效果和对细胞增殖的影响。方法:将两组干扰片段BCSG1-R1、BCSG1-R2及阴性对照片段BCSG1-C分别克隆入pGenesil-1穿梭质粒,经酶切鉴定及测序后,将测序正确的克隆转染入大肠杆菌DH5α中进行扩增Real-time PCR检测重组质粒转染MDA-MB-321细胞后,各组细胞内BCSG1-mRNA表达水平,Transwell细胞侵袭实验检测重组质粒对MDA-MB-321细胞侵袭能力的影响。结果:成功将干扰片段和阴性对照片段克隆入pGenesil-1质粒,构建出pGenesil-1-BCSG1-R1、pGenesil-1-BCSG1-R2和pGenesil-1-BCSG1-C重组质粒。与对照组相比,BCSG1-R1和BCSG1-R2组的BCSG1-mRNA表达水平明显下调(P0.05);干扰后,MDA-MB-321细胞侵袭能力明显下降(P0.05)。结论:成功构建BCSG1-RNAi重组质粒,可有效下调三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321内BCSG1的表达及细胞的侵袭能力。     

RNA干扰抗人免疫缺陷病毒感染的作用靶点

 目的综述了近年来RNA干扰技术在抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染中的作用靶点。方法以近几年具有代表性的文献为依据,进行分析、归纳和整理。结果与结论目前RNA干扰技术已广泛应用于HIV复制周期中的多个环节。RNAi不但可以靶向HIV基因组,而且可以通过降低多个与HIV复制密切相关且宿主非必需性的细胞因子的表达达到抑制HIV的目的。RNAi在抗HIV领域的广泛应用,必将成为解决病毒耐药性的问题、进而攻克艾滋病的有力武器。     

RNAi研究肝癌侵袭转移相关基因进展

RNA干扰(RNAi)是存在于真核生物体内的一种阻断外源基因表达的自我防御体系,是由双链RNA介导的使与其互补的具有同源序列的单链RNA进行特异性的降解过程。近年来,国内学者将RNAi技术广泛应用于肝癌相关基因的功能研究,综述了RNAi技术研究与肝癌转移复发相关基因功能的进展。     

RNAi的发展与应用

RNAi作为一种调控特定基因表达的手段,被称为基因组的免疫现象,已成为最近生物医学领域的研究焦点之一,其发现为疾病治疗提供了全新的途径,并给整个生物理论界带来了巨大而深远的影响。简要介绍了其机制和应用。     

RNAi检测IFRD1在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的：观察不同中医治法对大鼠肝癌干扰素相关发育调节因子1（IFRD1）表达的调控差异,以及IFRD1 在人肝癌细胞增殖中的作用。方法：（1）采用二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,Affymetrix rat 230A GeneChip arrays 检测肝癌组织IFRD1 表达的差异;（2）设计3 个人IFRD1 基因siRNA 靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721 人肝癌细胞株,MTT 法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR 检测该基因的表达差异。结果：（1）芯片结果显示,IFRD1 基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的下调作用,其中活血化瘀治法下调作用较明显,对照西药化疗反而具有上调作用;（2）采用MTT 法筛选到1 个IFRD1基因RNA 干扰有效靶序列,转染144h 后细胞的生长增殖得到了明显的抑制（与阴性对照组相比,P<0.01）;（3）实时荧光定量PCR 检测表明,转染72h 后该基因的表达明显降低。结论：SMMC-7721 肝癌细胞恶性增殖有赖于IFRD1 基因的高表达,而中药活血化瘀治法对其具有下调作用。     

虎杖查耳酮合酶基因RNAi载体的构建及其遗传转化

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度574 bp保守序列片段通过正、反2个方向插入表达载体p YLRNAi中,构建RNAi表达载体p YLRNAi-Pc CHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株,利用Northern blotting检测Pc CHS1基因表达水平,并应用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果成功构建Pc CHS1基因RNA干涉表达载体,获得了5株转Pc CHS1基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖Pc CHS1基因表达水平显著下调,并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到显著提高,其中最高量是对照植株的3.8倍(P0.05)。结论成功获得了干涉Pc CHS1基因表达下调的转化植株,抑制Pc CHS1基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量,为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。     

RNAi研究CK18在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌CK18表达的调控差异,以及CK18在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:(1)采用DEN诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,检测肝癌组织CK18表达的差异;(2)设计2个人CK18基因siRNA靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR检测该基因的表达差异。结果:(1)芯片结果显示,CK18基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的轻度调控作用,其中健脾益气治法下调作用较明显;(2)采用MTT法筛选到一个CK18基因RNA干扰有效靶序列,转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;(3)实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达已明显降低。结论:肝癌细胞恶性增殖有赖于CK18基因的高表达,目前常用治法对该基因的调控作用有限,因而该基因可望作为肝癌疗效筛选评价指标。     

RNAi研究TrxR1在肝癌细胞增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的观察不同中医治法对大鼠肝癌TrxR1表达的调控差异,以及TrxR1在人肝癌细胞增殖中的作用。方法将84只雄性Wistar大鼠随机分为正常组和模型组以及实验组,除正常组外均采用DEN诱发大鼠肝癌,实验组分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗,检测各组大鼠肝癌组织(正常组取肝组织)TrxR1表达的差异;设计2个人TrxR1基因siRNA靶点,将重组质粒通过脂质体转染入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测转染前后细胞生长增殖情况、Real-time-PCR检测该基因的表达差异。结果芯片结果显示,TrxR1基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,益气健脾治法明显下调其表达;采用MTT法筛选到一个TrxR1基因RNA干扰有效靶序列,脂质体转染144 h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达量明显降低。结论肝癌细胞恶性增殖有赖于TrxR1基因的高表达,益气健脾方药能显著下调该基因表达。     

三七PnbHLH转录因子过表达与PnCAS RNAi协同作用对皂苷合成的影响

该研究克隆了三七转录因子基因PnbHLH,其开放阅读框长为966 bp,编码321个氨基酸.构建了三七转录因子PnbHLH过表达载体,成功实现了转录因子PnbHLH基因过表达与植物甾醇合成支路关键酶基因PnCAS RNAi在三七细胞中的整合,探讨过表达PnbHLH基因与PnCAS RNAi协同作用对三七皂苷生物合成的调...     

小分子干扰RNA用于基因治疗的研究进展

 目的介绍小分子干扰RNA(siRNA)在基因治疗领域的研究进展。方法查阅国内外相关文献,进行分析、归纳和综述。结果siRNA用于基因治疗具有独特的优势,虽然还处于起步阶段,仍存在一些实际应用方面的问题,但随着研究的深入,这些问题正在或将被认识和解决。结论siRNA为基因治疗开辟了新的道路,具有广阔的应用前景。     

RNA干扰抑制生存素基因对肝癌细胞凋亡的影响

目的将生存素(survivin)基因特异性小干扰性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)直接转染肝癌hepG2细胞系,观察其对肝癌细胞survivinmRNA水平及细胞凋亡的影响。方法合成survivin特异性的siRNA序列1、序列2和对照序列,通过Lipofectamin2000进行直接转染。试验细胞随机分为4组,第1组为空白对照组,第2组以对照序列进行转染,第3组以序列1进行转染;第4组以序列2进行转染。转染后48h,通过半定量RT-PCR的方法检测survivinmRNA的水平。转染后72h,通过流式细胞仪检测各组的细胞凋亡指数。结果转染后48h,1组、2组、3组、4组survivinmRNA相对表达率(%)分别为:48.5±10.5、43.4±6.4、34.5±8.6、23.7±6.2(P1:3、P1:4、P2:4、P3:4均<0.05)。转染后72h,1组、2组、3组、4组细胞凋亡指数(%)分别为:10.7±3.1、11.8±3.5、15.9±3.5、18.6±3.2(P1:3、P1:4、P2:3、P2:4均<0.05)。结论survivin特异性siRNA直接转染肝癌细胞可抑制survivinmRNA的表达,促进肝癌细胞凋亡的发生。     

RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响

目的 采用RNA干扰技术（RNAi）抑制X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）,观察抑制前后人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为.方法 DNA重组技术合成针对人脑胶质瘤U251细胞XIAP基因三条siRNA（siRNA1,siRNA2,siRNA3）,以脂质体2000作为载体进行转染,RT-PCR法检测XIAP的mRNA表达,选择特异性较高的siRNA,以此 siRNA为标准建立20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L3个浓度梯度,转染细胞,Western blot 检测XIAP基因的蛋白表达,选出最低有效浓度;流式细胞仪检测抑制前后细胞周期和凋亡率.结果 siRNA成功转染了人脑胶质瘤细胞U251,转染率达到80%以上;RT-PCR检测siRNA2特异性较高;Western-blot检测终浓度为30 nmol/L的siRNA抑制效率较高;流式细胞仪检测停滞在G0/G1期的细胞增多,在S期的细胞减少,并且细胞的凋亡率增加.结论 通过RNA干扰可以抑制人脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达,促进人脑胶质瘤细胞凋亡,从而抑制细胞的生长.     

RNA干扰技术分子机制的研究新进展

RNA干扰是一种基因沉默技术。目前,它在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔前景。与此同时,RNA干扰分子机制的研究也取得了飞速发展,包括对转录水平、转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究。清晰阐述RNA干扰的作用机制将为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理论依据和有力工具。     

胃癌的诱导凋亡治疗

Sunrivin有可能是一个较理想的肿瘤特异性基因,是肿瘤反义基因治疗的较理想靶基因,应用srvivin反义基因治疗能够克服当前肿瘤反义基因治疗肿瘤特异性不高的缺点     

RNA干扰在抗HIV感染中的研究进展

 目的　综述近年来RNA干扰在抗HIV感染的研究进展。方法　检索国外最新发表的代表性研究论文,并对试验结果进行分析、归纳。结果与结论　利用RNA干扰这一自然存在的、进化保守的抗病毒感染机制,以防疗HIV等病毒感染已成为新的研究热点,并取得了有希望的基础研究成果。在未来,有望成为抗HIV等病毒感染的有效方法。