改良大鼠后囊膜混浊模型的建立及晶状体上皮细胞的变化

目的:改良法建立大鼠后发性白内障动物模型并观察LEC在PCO过程中的动态变化。方法:SD大鼠50只在连续环形撕囊、水分离后行晶状体囊外摘除术(ECLE),娩核后使用无菌空气恢复前房。分别于术后0,3,7,14及28d对术眼进行裂隙灯检查并处死动物,摘除眼球行光镜观察,免疫组化检测LEC的α-SMA表达。结果:100%术眼后囊膜存在,84%的鼠眼可用于检测。术后0h于前囊下和赤道部的内表面观察到LEC。PCO在术后3d出现,出现囊膜皱缩,整个晶体囊膜出现纺锤形细胞。术后7d时后囊膜明显混浊,见较多纺锤形细胞分布。所有动物于术后14d出现明显后囊膜皱缩,可见新生晶体纤维。术后28d见明显后囊膜增厚,新生晶体纤维填充囊袋,后囊膜未见细胞。LEC形态及分布恢复到术后0h状态。免疫组化检测见术后3d时α-SMA阳性表达。结论:改良法成功建立大鼠PCO模型,LEC在PCO形成中出现形态和分布上的动态变化。其将为在分子水平上探索PCO的发病机制及防治方法提供合适研究载体。     

大鼠后囊膜混浊模型的建立

目的建立一种新的、具有实用价值的大鼠后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)动物模型。方法12只SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为4组,每组3只,每只大鼠双眼施行晶状体囊外摘除术(extracapsular lens extrac-tion,ECLE);在手术后即刻、第1天、第7天、第14天摘除眼球,进行组织病理学观察,研究残留晶状体上皮细胞(lensep-ithelial cells,LECs)增殖、移行和后囊膜的动态变化;应用方差分析比较LECs增殖数量。结果所有大鼠均成功施行ECLE手术。手术后即刻可见前囊膜下及赤道部有单层的LECs排列;术后第1天赤道部形成由2～3层细胞组成的细胞团块,LECs沿着囊膜向后囊迁移;术后第7天囊袋赤道部及后囊膜下形成多层细胞结构,赤道部晶状体纤维样物质增加,部分后囊膜出现明显皱褶;术后第14天囊袋赤道部及后囊膜下LECs形成团块,赤道部形成晶状体纤维样结构,赤道部Soemmering环形成。随时间推移,单位面积LECs数量明显增加(P<0.05)。结论大鼠ECLE手术后可成功建立后囊膜混浊模型。     

后囊膜混浊的体外上皮-间质转化模型的建立

背景 上皮-间质转化(EMT)是导致后囊膜混浊(PCO)的主要发病机制之一,研究LECs的EMT过程对PCO的防治具有重要意义,但目前缺乏研究EMT的PCO体外细胞模型. 目的 建立新的人晶状体囊外摘出术PCO的体外囊袋培养模型,探讨PCO形成过程中LECs EMT的发生情况.方法 利用健康供体的40只尸眼行体外模拟的白内障摘出术,游离晶状体囊袋后用昆虫针固定于培养皿,置于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养4周,分别于培养后0、3、7、14和28 d在光学显微镜下观察培养囊袋中LECs的生长情况;收集0、3、7和28 d的囊袋组织制备组织病理学切片,采用苏木精-伊红染色法检测囊袋上LECs的细胞形态;采用免疫组织化学染色法检测EMT标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin蛋白在囊袋上LECs中的表达和定位;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测不同时间点囊袋上LECs中α-SMA、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白的表达变化. 结果 未进行培养的囊袋后囊膜上未发现LECs生长,囊袋培养后3d可见后囊膜周边出现LECs并逐渐向中央区增生,培养后7 d LECs完全覆盖后囊膜,略呈铺路石样外观并出现皱褶,此后随着培养时间的延长皱褶的数量增多并伸长,囊袋张力增强.免疫组织化学染色结果显示,随培养时间的延长,囊袋上LECs中E-cadherin的表达强度逐渐下降,而α-SMA和Vimentin的表达强度逐渐增强.实时荧光定量PCR检测表明,培养后0、3、7、14和28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为3.35±0.13、1.47±0.20、1.13±0.14、1.00±0.85和0.23±0.03,Vimentin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.73、1.05±0.14、2.24±0.43、2.84±0.34和8.570±0.40,α-SMA mRNA的相对表达量分别为1.00±0.06、2.68±0.28、4.24±0.05、2.05±0.90和15.30±0.19,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherin mRNA:F=23.430,P=0.000;Vimentin mRNA:F=8.915,P=0.002;α-SMA mRNA:F=103.500,P=0.000),其中培养后28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量最低,而Vimentin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量均最高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测结果表明,培养后0、3和28 d囊袋上LECs中E-cadherhin蛋白表达的灰度值分别为1.443±0.017、1.023±0.003和0.568±0.018,Vimentin蛋白表达的灰度值分别为0.565±0.012,1.156±0.007和1.241 ±0.009,α-SMA蛋白表达的灰度值分别为0.195±0.045,0.693±0.036和1.501±0.005,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherhin:F=2 787.000,P=0.000:Vimentin:F=4 488.000,P=0.000;α-SMA:F=1 173.000,P=0.000),其中培养后3、28 d LECs中E-cadherhin蛋白表达明显低于0d,而Vimentin和α-SMA蛋白表达明显高于0d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究中的新囊袋模型进行LECs体外培养能模拟体内白内障术后晶状体后囊LECs的EMT自然过程,是探讨PCO发生机制和方法新的体外细胞模型.     

大鼠晶状体囊外摘出术后LECs基因差异表达的研究

目的 探讨采用基因芯片技术检测大鼠晶状体囊外摘出术(ECLE)后晶状体上皮细胞(LECs)基因表达的差异.方法 20只SD大鼠随机分成4组,双眼行ECLE;分别于手术后即刻及1、7、14 d处死大鼠,完整取出囊膜;用含有5 705个大鼠基因探针的芯片分别检测术后1、7、14 d与术后即刻组相比较的基因表达差异;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证芯片检测结果 .结果 所有大鼠均成功施行双眼ECLE手术,术后出现PCO及晶状体物质再生.芯片实验质量控制可靠,结果 可信.术后3个时间点差异表达基因共694条.发生差异表达的基因范围非常广泛,涉及所有细胞功能类别.结论 成功地建立了大鼠ECLE术后PCO及晶状体物质再生模型.大鼠ECLE术后LECs基因差异表达极其复杂,提示PCO及晶状体再生的分子机制复杂,调控因素多.     

去整合素kistrin对兔眼晶状体后囊Ⅳ型胶原表达的影响

背景 白内障囊外摘出术后残留的晶状体上皮细胞(LECs)增生是后囊膜胶原产生进而形成后发性白内障的生物学基础,去整合素可与细胞外基质(ECM)竞争结合整合素分子,理论上可以防治后发性白内障的形成,但其具体的作用机制有待进一步研究. 目的 研究去整合素kistrin对兔眼晶状体后囊Ⅳ型胶原表达的影响.方法24只新西兰大白兔按照随机数字表法分为kistrin注射组及生理盐水对照组,每组12只.两组兔均行右眼透明晶状体囊外摘出术,建立兔晶状体后囊膜混浊(PCO)模型,术毕kistrin注射组囊袋内注入80 mg/L kistrin 0.2 ml,生理盐水对照组注入等量生理盐水.术后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯下观察实验动物晶状体PCO情况,并按照Odrich法进行分级.术后14d及3个月分别处死两组兔各6只,取出晶状体进行常规石蜡切片,行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察晶状体病理改变;行Masson染色观察晶状体囊袋内胶原纤维增生情况,免疫组织化学法检测兔晶状体后囊Ⅳ型胶原的表达. 结果 术后14 d,生理盐水对照组与kistrin注射组各级PCO的眼数差异无统计学意义(P=0.093),术后1、2、3个月,生理盐水对照组形成2～3级PCO的眼数明显多于kistrin注射组,差异均有统计学意义(P=0.041、0.014、0.022).晶状体组织学检查表明,术后14 d生理盐水对照组LECs层数明显多于kistrin注射组,瞳孔区后囊膜可见单层细胞黏附,kistrin注射组后囊则保持光滑,术后3个月可见生理盐水对照组晶状体后囊的LECs转化为纤维细胞,kistrin注射组较少见.Masson染色显示术后3个月生理盐水对照组晶状体前囊膜撕囊口处与后囊膜之间胶原纤维的蓝绿色染色明显多于kistrin注射组.免疫组织化学染色表明,术后14 d及30 d,生理盐水对照组晶状体后囊膜Ⅳ型胶原的灰度值均明显低于kistrin注射组,差异均有统计学意义(P=0.000、0.001). 结论 去整合素kistrin能够抑制兔眼晶状体囊外摘出术术后晶状体后囊LECs和Ⅳ型胶原增生.     

大鼠后发性白内障发生过程中晶状体纤维分化的初步研究

目的在组织学和mRNA水平上初步了解大鼠后发性白内障模型形成过程中晶状体纤维的分化。方法对48只SD大鼠行晶状体囊外摘除术,在术后即刻、1d、3d、1周、2周、1个月、2个月、3个月行裂隙灯显微镜观察和HE染色;取不同时间点后发性白内障组织,采用半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测晶状体蛋白基因-αA、αB、βB1、βB2、βA2、γD的表达水平。结果所有大鼠术后均发生晶状体后囊膜混浊（PCO）。术后即刻,晶状体前囊膜下残留晶状体上皮细胞（LEC）;术后1d,LEC已增殖迁移至晶状体后囊膜中央区;术后3d,晶状体后囊膜中央轻度混浊、皱缩,晶状体囊袋内布满增生的LEC,周边部发生晶状体纤维分化。术后7d,后囊膜中央混浊继续加重,呈放射状皱褶,周边形成Seommering环。术后14d,瞳孔区囊膜组织纤维机化,Seommering环更为明显;术后1个月。新生晶状体纤维填满晶状体囊袋,形成类似正常晶状体的赤道部。术后2、3个月,晶状体纤维继续增生,体积接近正常晶状体。半定量RT-PCR显示术后αA、αB、βB1、βB2、βA2、γD mRNA的表达逐渐增加。结论SD大鼠行晶状体囊外摘除术后短期内即会发生明显的后发性白内障,并表达α、β和γ晶状体蛋白。该动物模型可用于后发性白内障的发病机制和晶状体再生的应用基础研究。     

Survivin基因在大鼠后发性白内障动物模型中的表达

目的建立SD大鼠后发性白内障(PCO)动物模型,并检测Survivin调控基因在PCO中的表达变化,探讨Survivin对PCO生成的影响。方法取成年SD大鼠60只随机分为6组,其中10只(n=10)作为正常对照组,另50只SD大鼠于腹腔麻醉联合表面麻醉下行右眼晶状体囊外摘出术(ECLE),分为A、B、C、D、E,每10只(n=10)为1组,分别于术后即刻、3、7、14、28 d对术眼进行裂隙灯显微镜及组织病理学检查,观察PCO形成的时间、部位、发展过程及组织形态学改变,并采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法及免疫组化方法检测Survivin基因在术后不同时间点PCO中的表达。结果 PCO在术后3 d出现,可见后囊膜皱褶,术后7、14 d后囊膜混浊明显,所有动物于术后14 d出现明显的后囊膜皱缩,可见新生晶状体纤维,术后28 d可见明显的后囊膜增厚,新生晶状体纤维填充囊袋,并且透明度下降。免疫组化和RT-PCR于正常对照组及术后即刻A组均未检测到Survivin的表达,B、C、D、E4组术后不同时段的PCO组织中可检测到不同程度Survivin的表达,其中,免疫组化显示C、D 2组表达较为明显,RT-PCR则显示C组达到表达高峰,D组表达开始下降,但较E组表达强,B组表达最弱。结论 SD大鼠可成功建立PCO动物模型并检测到Survivin调控基因的表达,Survivin的表达在PCO的形成过程中具有相应的时相性,提示Survivin与PCO的形成机制具有一定相关性,对探索PCO的基因治疗方法具有参考价值。     

Ccnd1反义寡核苷酸脂质体对囊外摘出术后大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探索Ccnd1反义寡核苷酸(Ccnd1 antisense oligonucleotides,Ccnd1-ASON)脂质体对晶状体囊外摘出术(extracapsular extraction of lens,ECLE)后大鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)增生的抑制作用.方法 48只SD大鼠随机分为3组,双眼行ECLE,术中前房内分别注入Ccnd1-ASON脂质体溶液(反义组)、Ccnd1基因正义寡核苷酸(Ccnd1 sense oligonucleotides,Ccnd1-SON)脂质体溶液(正义组)、无药脂质体溶液(无药组)50 μL;每组随机取4只分别于术后即刻、1 d、7 d、14 d处死,实时荧光定量PCR检测LECCcnd1表达变化,组织病理学检测单位面积LEC数量,免疫组织化学检测LEC周期蛋白(cyclin)D1表达,应用方差分析进行统计学处理.结果 术后1 d、7 d、14 d,Ccnd1表达量反义组分别为0.141 5、0.274 3、0.340 6,低于正义组(0.786 1、1.162 3、0.753 7)和无药组;晶状体组织单位面积(mm2)LEC数量反义组分别为633±65、1 636±212、2 440±359,低于正义组(808±73、2 476±349、3 115±316)和无药组(845±78、2 242±303、3 133±331)(P＜0.05),正义组和无药组之间无明显差异(P＞0.05);晶状体组织单位面积(mm2)Cyclin D1阳性细胞积分光密度值反义组分别为6.18±0.67、11.22±1.66、17.38±3.00,低于正义组(7.74±0.88、16.03±2.40、24.56±2.49)和无药组(7.60±0.66、16.17±2.03、25.93±2.21)(P＜0.05),正义组和无药组之间无明显差异(P＞0.05).结论 Ccnd1-ASON前房注射能有效降低大鼠ECLE后LEC Ccnd1和Cyclin D1表达,抑制LEC增殖,减轻后囊膜混浊.     

甘糖酯对囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的应用甘糖酯（PGMS）抑制囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）的增生和移行能力,探讨其对后发性白内障的预防和治疗作用。方法健康纯种白兔30只模拟白内障囊外摘出术（ECCE）建立兔LECs体外培养的囊袋模型,将制备好的囊袋浸泡于不同质量浓度的PGMS中分别作用不同时间。实验组分别用0.2、0.4、0.8g/LPGMS浸泡晶状体囊袋,作用时间分别为2、5、10min,空白对照组晶状体囊袋不用PGMS浸泡。囊袋置于含质量分数5%胎牛血清的DMEM培养液中培养。7d后以囊膜细胞覆盖率作为评价指标,观察兔LECs增生、移行情况;应用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查,观察LECs的形态及其与晶状体囊袋的结合情况;透射电镜下观察后囊膜上LECs的超微结构。结果对照组在培养的第3天可见LECs呈铺路石样生长,第7天后囊膜LECs的覆盖率达100%;各实验组LECs的覆盖率较对照组明显下降（P〈0.05）。实验组随着PGMS质量浓度的增加和作用时间的延长,细胞增生、移行的速度明显减慢,其中质量浓度为0.8g/L,作用时间5min和10min组显著抑制兔LECs生长,与对照组和0.2g/LPGMS培养组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。病理组织学检测表明0.4g/L及0.8g/LPGMS作用2min组晶状体后囊膜LECs数目较对照组和0.2g/LPGMS组明显减少,细胞与囊膜连接不紧密。透射电镜下可见对照组和0.2g/LPGMS组LECs结构完整;0.4g/L及0.8g/LPGMS组可见细胞内有较多溶酶体,细胞质空泡样变性等退行性改变。结论 PGMS对囊袋培养的兔LECs的增生、移行的抑制作用呈质量浓度及时间依赖性。     

原代培养兔晶状体上皮细胞的环境和细胞状态的变化

目的:探讨体外原代培养的兔晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)分泌活性转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)和异常表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的状况变化方法:体外原代培养兔眼LEC,当细胞接近融合时转板培养,观察细胞转板培养后1,6,12d的状态变化,并采用ELISA法检测各时项培养液上清中TGF-β1的水平,免疫细胞化学和计算机图像分析统计各时项细胞中α-SMA的表达水平。结果:转板培养12d的细胞活性TGF-β1的水平明显高于转板培养1和6d的水平(均P<0.05),同时转板培养12d的细胞表达α-SMA的水平分别明显高于转板培养1和6d的水平(P<0.05);而且α-SMA的表达量随着TGF-β1水平的升高而升高,两者高度正相关(r=0.995,P<0.01)。结论:原代培养的LEC活性TGF-β1逐渐增多,向表达有α-SMA的肌成纤维细胞转分化。