星形胶质细胞条件培养液对体外模拟脑缺血再灌注损伤神经元的作用

目的：探讨星形胶质细胞(Ast)条件培养液(ACM)对体外模拟脑缺血再灌注损伤神经元的影响。方法：分离纯化培养大鼠大脑皮质Ast和神经元,体外模拟脑缺血再灌注损伤模型,用ACM培养损伤后的神经元,测定其神经元的活性、存活率、死亡率、培养液乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率和NOS强阳性细胞的表达量。结果：ACM能使脑缺血再灌注损伤神经元的活性和存活率明显提高,使死亡率、LDH的漏出率和NOS强阳性细胞的表达量显著降低。结论：(1)体外模拟脑缺血再灌注损伤神经元的变化具有一定的规律性;(2)ACM对受损的神经元具有重要的保护和修复作用;(3)Ast在脑缺血预适应中发挥重要的作用。     

TNFα刺激的星形胶质细胞条件培养液对海马神经元的兴奋作用(英文)

为了探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNFα)刺激的星形胶质细胞对神经元的作用,本研究将体外纯化培养的大鼠海马星形胶质细胞,用反相高效液相法测定TNFα刺激后细胞培养液内谷氨酸的含量;将TNFα刺激后的星形胶质细胞条件培养液(astrocytic conditioned medium,ACM)作用于培养的海马神经元,运用免疫细胞化学方法和图像分析技术研究神经元NF-κBp65和谷氨酸的表达。结果表明:(1)TNFα可明显促进星形胶质细胞释放谷氨酸,(2)ACM作用1 5 min即可诱导神经元NF-κBp65的核表达,30 min达高峰,180 min恢复至对照水平,(3)ACM作用60 min可使谷氨酸免疫反应阳性神经元平均光密度明显升高,持续至240 min。提示,TNFα刺激的星形胶质细胞可通过释放谷氨酸等可溶性物质使神经元快速激活、兴奋性升高。     

TNFα刺激的星形胶质细胞条件培养液对海马神经元的兴奋作用

目的:探讨肿瘤坏死因子-α刺激的星形胶质细胞对神经元的作用。材料和方法:体外纯化培养大鼠海马星形胶质细胞,采用反相高效液相法测定TNFα刺激后细胞培养液内谷氨酸的含量;将TNFα刺激后的星形胶质细胞条件培养液（Astrocytic Conditioned Medium,ACM）作用于培养的海马神经元,运用免疫细胞化学方法和图像分析技术研究神经元NF-κBp65和谷氨酸的表达。结果:（1）TNFα可明显促进星形胶质细胞释放谷氨酸;（2）ACM作用15min即可诱导神经元NF-κBp65的核表达,30min达高峰,180min恢复至对照水平;（3）ACM作用60min可使谷氨酸免疫反应阳性神经元平均光密度明显升高,持续至240min。结论:TNFα刺激的星形胶质细胞可通过释放谷氨酸等可溶性物质使神经元快速激活、兴奋性升高。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

白藜芦醇对星形胶质细胞ATP释放的影响

目的研究白藜芦醇对体外培养的星形胶质细胞牵拉损伤后三磷酸腺苷（ATP）释放的影响,探索其对中枢神经保护作用的可能机制。方法采用不同剂量的白藜芦醇与星形胶质细胞共同培养12h后,进行牵拉损伤,检测不同实验组星形胶质细胞内、外ATP含量,并进行乳酸脱氢酶（LDH）漏出量的测定。结果牵拉损伤使星形胶质细胞分泌ATP明显增加,相反细胞内ATP含量明显下降（P〈0．05）;1μmol白藜芦醇能够使星形胶质细胞损伤后ATP分泌进一步增加（P〈0．05）;而100μmol白藜芦醇能减少损伤后ATP分泌（P〈0．05）。对细胞进行LDH漏出量的检测发现,牵拉损伤能够使星形胶质细胞的LDH漏出量增加（P〈0．05）,1μmol白藜芦醇进一步加剧了LDH漏出（P〈0．05）,100μmol白藜芦醇能够有效减少星形胶质细胞的LDH漏出（P〈0．05）。结论星形胶质细胞受到牵拉损伤后,100μmol白藜芦醇能够减少其ATP释放,且能够减少LDH漏出,进而对星形胶质细胞起到保护作用。     

星形胶质细胞正常条件培养液对体外脑缺氧/复氧损伤神经元的影响

目的:探讨星形胶质细胞正常条件培养液(NCMA)对体外脑缺氧/复氧(H/R)损伤神经元的营养性作用。方法:先行大鼠大脑皮质星形胶质细胞和神经元的分离纯化培养,然后用NCMA以不同的浓度培养正常及脑H/R损伤的神经元,通过MTT法测定其神经元的活性和存活率。结果:NCMA能提高正常及脑H/R损伤神经元的活性和存活率。结论:NCMA对培养的神经元具有营养性支持作用。     

星形胶质细胞条件培养液对体外模拟脑缺血再灌注损伤神经元抗凋亡作用的研究

目的：探讨体外模拟脑缺血再灌注(Is/Rp)损伤条件下星形胶质细胞条件培养液(ACM)、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液（ACMk）及ACM与抗呆Ⅰ号联合应用（ACM+K）对损伤神经元表达神经元特异性的烯醇化酶（NSE）、bcl-2、bax和caspase-3的影响。 方法： 先分别进行大鼠大脑皮质星形胶质细胞（Ast）和神经元的分离纯化培养及体外模拟脑Is/Rp损伤模型的建立，然后用Rp-18 h后收集的ACM与ACMk、ACM+K以1∶5的浓度来培养损伤后的神经元，最后利用免疫细胞化学染色技术测定其神经元在Is-4 h和Rp-3 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h后表达NSE、bcl-2、bax和caspase-3的变化。 结果： ACM、ACMk和ACM+K均能使受损神经元表达NSE和bcl-2的能力增强，表达bax和caspase-3的能力降低。其作用：ACMk>ACM+K>ACM。 结论： （1）通过受损神经元表达NSE的变化反映出ACM对受损神经元具有重要的保护和修复作用；（2）通过受损神经元表达bcl-2、bax和caspase-3的变化表明ACM具有抗凋亡作用; (3) 抗呆Ⅰ号可通过Ast间接地保护和修复受损的神经元。     

腺苷对体外培养的海马缺糖缺氧神经元的保护作用

目的:观察缺糖缺氧对大鼠海马培养神经元的影响及腺苷的保护作用。方法:取培养12d的海马神经元, 分为对照组和腺苷组, 同时于缺糖缺氧环境中培养0.5-4h后取出, 立即更换原神经元培养液在常氧下继续培养24h。于不同时间取出, 收集培养液, 测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量, 用图像分析仪测定神经元胞体面积, 并用4%台盼蓝染色, 计算神经元存活百分率。同时用原位末端标记(TUNEL)法检测神经元凋亡。结果:缺糖缺氧后海马神经元胞体肿胀, 体积变大, LDH渗出含量增多, 神经元存活率减少。恢复糖和氧供应后24h, 海马神经元LDH渗出含量进一步增多, 细胞存活率进一步减少, 凋亡神经元百分率明显增多。经腺苷预处理的海马神经元缺糖缺氧后, 神经元LDH渗出明显少于对照组, 神经元胞体面积增大程度轻于对照组, 神经元存活率明显高于对照组。缺糖缺氧0.5-3h再恢复氧和糖供应后24h, 腺苷组凋亡神经元百分率亦明显低于对照组。结论:缺糖缺氧可引起海马神经元严重损伤, 神经元损伤程度与神经元存活率、LDH渗出含量的改变呈对应变化。腺苷能减少缺糖缺氧后神经元的损伤, 减少缺糖缺氧后神经元凋亡, 提示腺苷对缺糖缺氧海马神经元具有一定的保护作用。     

红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用

目的 观察红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液（EACM）对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用。 方法 原代培养神经干细胞和1型星形胶质细胞,收集红细胞生成素(EPO)刺激的星形胶质细胞上清液,用于神经干细胞分化实验的研究。对分化后的细胞进行免疫细胞化学染色,计算其分化为神经元的比率;同时利用FeSO₄和H₂O₂制造细胞损伤模型,用EACM继续培养48h,然后检测细胞活性和存活细胞数。 结果 EACM组神经干细胞分化明显,神经元比率较星形胶质细胞上清组和对照组均有明显增加。分化后的细胞中加入H₂O₂后,继续用EACM培养的实验组吸光度(A)值和细胞存活百分比均较对照组高。 结论 红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞有促其向神经元分化的作用,并对分化后的细胞有保护作用。     

缺氧对血脑屏障细胞分泌组织型纤溶酶原激活物的影响

目的：探讨缺氧对体外培养鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞分泌组织型纤溶酶原激活物（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ＴＰＡ）的影响。方法：分别对新生小鼠脑微血管内皮细胞、星状胶质细胞进行缺氧条件下培养,常规培养作为空白对照,每组各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果：缺氧后内皮细胞ＴＰＡ活性明显增高（Ｐ＜０．０１）,星形胶质细胞ＴＰＡ活性无明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论：体外培养鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞均能合成分泌ＴＰＡ;缺氧状态下脑微血管内皮细胞产生的ＴＰＡ活性增高。内皮细胞分泌的ＴＰＡ是脑缺氧缺血致不可逆神经元损伤的一个重要媒介,而星形胶质细胞分泌的ＴＰＡ则主要参与发育阶段需要细胞迁移的重建活动。     

预热应激对缺氧血管内皮细胞的保护作用及其机制

目的:研究预热应激对缺氧血管内皮细胞的保护作用及其发生机制,探索新的防治措施。方法:将血管内皮细胞分为:(1)缺氧组;(2)热应激组;(3)预热应激+缺氧组;(4)对照组。用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,以台盼兰染色法测定细胞死亡率,用Griess化学法测定细胞培养液中NO₂^-含量,以观察细胞NO生成量。结果:缺氧血管内皮细胞LDH的释放量和细胞死亡率显著大于对照组,39℃预热应激可使其分别降低29.47%和33.67%,41℃预热应激对缺氧细胞无明显保护作用。缺氧使血管内皮细胞NO生成量显著降低。39℃预热应激的缺氧血管内皮细胞NO生成量显著高于缺氧组,41℃预热应激的缺氧血管内皮细胞NO生成量显著低于对照及相应的缺氧组;血管内皮细胞NO生成量与细胞LDH释放量及细胞死亡率呈显著负相关。结论:一定强度的预热应激可以对缺氧血管内皮细胞产生保护作用。细胞NO产生增多在这种保护作用机制中可能具有重要作用。     

粉防己碱对心肌顿抑损伤的保护作用

用兔冠脉前降支结扎缺血再灌模型,观察粉防己碱（Ｔｅｔ）对心肌顿抑损伤的保护作用并分析其作用机理。结果示：①顿抑心肌收缩舒张功能明显降低,心电图ＳＴ段抬高,血清ＬＤＨ水平升高,左室湿重增大,Ｔｅｔ可减轻缺血及再灌后心肌功能的损害,降低血清ＬＤＨ水平与心肌湿重;②顿抑组血清ＮＯ水平略升高,Ｔｅｔ组血清ＮＯ无明显变化;③顿抑组心肌Ｎａ＾＋－ｋ＾＋－ＡＴＰ酶及Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶活力均明显下降,Ｔｅｔ组Ｔ     

脊髓提取液对体外培养的神经细胞在缺气损伤环境中的作用

本实验目的在于研究小鼠胚胎脊髓提取液对损伤环境中的体外培养脊髓和背根节神经细胞的保护作用。神经细胞取自１２～１４ ｄ 胚胎小鼠脊髓和背根节,接种于２４ 孔板中。培养第５ ｄ 时在培养板中加入２５０ ｍ ｇ／Ｌ 脊髓提取液,对照组不加;培养第１０ ｄ 在液体表面加入液体石蜡造成缺气损伤。继续培养４、８、１２、２４ ｈ,然后去除液体石蜡,观察细胞形态和Ｋ＋ 、ＬＤＨ 的变化,用Ｍ ＴＴ 方法检测细胞活性,通过ＮＳＥ免疫组化反应显示神经元存活状况。结果表明：损伤神经元出现细胞肿胀、失去折光性、核偏位以及ＮＳＥ 染色变弱;而在培养液中加入脊髓提取液,可以减轻这种“缺气”造成的损伤,提高体外培养神经元在损伤环境中的生存率,保持细胞的活性和细胞膜的通透性。     

Leakage of cytoplasmic enzymes from rat heart by the stress of cardiac beating after increase in cell membrane fragility by anoxia

The effects of spontaneous beating after anoxia and the pumping stress induced by a left ventricular balloon on the leakage of myocardial enzymes from the isolated perfused rat heart were investigated. Beating of the heart was arrested by perfusion with high-K⁺ medium. When the beating was arrested during reoxygenation after anoxia, the leakage of lactate dehydrogenase (LDH) was significantly lower than during reoxygenation with spontaneous cardiac beating. After changing from K⁺ arrest to spontaneous beating by perfusion with low-K⁺ medium during reoxygenation, the leakage of LDH increased markedly. Imposition of left ventricular wall stress on the K⁺-arrested heart by repetitive passive distension during aerobic perfusion and after 20 min and 60 min of anoxia caused LDH leakages of 1.0, 4.6 and 21.0 units/g in 30 min, respectively. Under this mechanical stress, the release of LDH as a percentage of its total myocardial activity coincided well with that of cytoplasmic aspartate aminotransferase (AST), while the percentage release of mitochondrial AST was much less. These results appeared to indicate that the leakage of cytoplasmic enzymes during reoxygenation is accelerated by cardiac beating because of fragility of the cell membranes developing during the preceding anoxia.     

Protection of reoxygenated cardiomyocytes against sarcolemmal fragility: the role of glutathione

This study addressed the question of whether the sarcolemmal fragility of cardiomyocytes after anoxia and subsequent reoxygenation can be altered by modulation of the cellular glutathione state. Isolated ventricular cardiomyocytes (from adult rats) were exposed to 120 min anoxia and subsequently to 30 min reoxygenation. Osmotic stress was generated by reduction of medium osmolarity from 270 to 80 mosmol/l and sarcolemmal fragility assessed by the leakage of lactate dehydrogenase (LDH). Under normoxic conditions 6.7±1.0 % of total LDH activity was found extracellularly. Hyposmolar reoxygenation, but not hypoosmolar anoxia, increased LDH release (17.9±2.7% of total, P<0.05). Increasing cellular glutathione content by pretreatment with N-acetylcysteine (1 mM) reduced LDH release following hyposmolar reoxygenation (12.3±1.9% vs. 18.2±2.9% of LDH in medium, P<0.05). Depletion of glutathione content by pretreatment with buthionine sulphoximine (BSO, 200 μM), increased LDH release following osmotic stress already in normoxia (10.5±1.8% of LDH in medium; P<0.05 vs. no BSO), and even further after reoxygenation (21.8±3.2%, P<0.05 vs. normoxia). We conclude that the increased sarcolemmal fragility in reoxygenated cardiomyocytes is due to reoxygenation in the presence of reduced antioxidant defence. Received: 7 January 1999 / Received after revision: 23 March 1999 / Accepted: 31 March 1999     

限定骨骼肌提取液（ME，10～50kDa）影响培养的大鼠脊髓腰段运动神经元生长的定量研究

用胎鼠的限定骨骼肌提取液（ＭＥ，１０～５０ｋＤａ）作用于无血清培养的胚胎大鼠脊髓腰段腹角细胞后，用四唑盐（ＭＴＴ）微量自动比色定量法和ＬＤＨ活性测定法检测了骨骼肌提取液对大鼠脊髓运动神经元生长存活的生物活性，结果显示：细胞培养４ｄｉｖ后，ＭＴＴ微量比色的ＯＤ值随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，含骨骼肌提取液２００和４００μｇ／ｍｌ蛋白的实验孔与单纯无血清的对照孔比较有极显著性差异（Ｐ＜０．００１），说明２００μｇ／ｍｌ以上浓度的骨骼肌提取液对脊髓腹角神经元的生长有明显的促进作用。细胞培养１４ｄｉｖ后，ＬＤＨ活性测定ＯＤ值的线性回归斜率亦随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，说明存活细胞数的增加。实验说明培养神经细胞的ＭＴＴ和ＬＤＨ的检测方法有可能成为评估运动神经营养因子活性的指标。     

NMDA对新生大鼠皮层神经元的兴奋毒作用

目的:建立NMDA诱导原代培养皮层神经元兴奋毒损伤模型,探讨NMDA对NMDA受体过度活化诱导兴奋性神经毒的可能途径。方法:原代培养新生大鼠大脑皮层神经元,通过倒置显微镜形态学观察、细胞活力检测(MTT及LDH释放的检测)及胞内Ca2+的动态测定,探索NMDA诱导毒性作用的适当浓度及时间。通过对ROS、NO检测,分析NMDA诱导毒性作用于线粒体的损伤情况。结果:NMDA(100μmol/L/2 h)引起皮层神经元形态学改变,且引起神经元细胞活力时间和浓度依赖性的下降,由同时伴随LDH释放增加(P<0.05),ROS和NO的生成量明显增加(P<0.05),皮层神经元内Ca2+的快速升高,并维持在高水平。结论:NMDA诱发皮层神经元明显的细胞毒性作用,提示NMDA过度活化NMDA受体后通过神经元膜内Ca2+超载造成ROS和NO的生成量增加,导致皮层神经元产生毒性损伤。     

降钙素基因相关肽对培养的血管内皮细胞缺氧再给氧的影响

目的:观察降钙素基因相关肽(CGRP)对培养的人脐静脉血管内皮细胞缺氧再给氧损伤的影响。方法:用培养的人脐静脉血管内皮细胞建立缺氧再给氧模型,观察血管内皮细胞在缺氧再给氧状态下台盼兰摄取率、细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性,钙、镁含量和丙二醛(MDA)含量的变化以及CGRP对培养的血管内皮细胞的影响。结果:1×10^-8mol/LCGRP可降低缺氧再给氧时血管内皮细胞的台盼兰摄取率、钙含量及MDA含量,降低LDH活性,减少细胞内镁的丢失。结论:CGRP对缺氧再给氧的血管内皮细胞具有直接保护作用,其作用可能与CGRP具有抗脂质过氧化,减轻细胞内钙超载以及减少镁与酶的丢失有关。     

梓醇对谷氨酸诱导SD大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的梓醇对谷氨酸诱导SD大鼠海马神经元损伤的影响。方法将培养7～9d的SD大鼠海马细胞进行NSE鉴定,然后随机分为:正常对照组;谷氨酸损伤组(Glu);谷氨酸损伤前予梓醇组(CAT+Glu)。采用倒置显微镜观察细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,比色法测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,流式细胞术测定细胞凋亡率。结果与正常对照组比较,0.1mmol·L-1谷氨酸作用于海马神经元24h,出现明显细胞损伤,细胞存活率下降,培养液中LDH含量明显增加,细胞凋亡率增高(<0.01);0.2、1.0、5.0mg·L-1的梓醇可不同程度的改善谷氨酸损伤引起的神经细胞形态的改变,提高细胞存活力,减少LDH的漏出,降低细胞凋亡率,并呈一定的剂量依赖性。结论梓醇对谷氨酸诱导的海马神经细胞损伤有保护作用。