散发性大肠癌APEX基因两个单核苷酸多态性的检测及分析

目的　检测分析中国人散发性大肠癌APEX基因 12 4 7位点、2 197位点的单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymorphism ,SNP)状况 ,探讨其与散发性大肠癌发生的关系。 方法　变性梯度凝胶电泳 (denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、单链构像多态性 (singlestrandconformationpolymorphism ,SSCP)分别检测 15 0例大肠癌及其周围正常粘膜DNA的APEX基因 12 4 7位点、2 197位点SNP ,并直接测序验证结果。结果　 12 4 7位点经DGGE检测及测序证实有 17例存在A→G的SNP ,导致I 6 4V改变 ;经SSCP检测和测序证实 2 197位点有 38例T→G的SNP ,并导致D14 8E改变。结论　APEX基因SNP分布可能具有明显的种族差异 ,12 4 7A→GSNP可能与中国人大肠癌发生和恶性程度相关     

3种常用单核苷酸多态性检测方法的应用比较

目的：通过比较变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis．DGGE)、单链构像多态性(single—stranded conformational polymorphism，SSCP)、限制性酶切检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的优缺点。为不同条件下选择最适合的SNP检测方法提供借鉴。方法：DGGE、限制性酶切检测150例大肠癌APEX基因第3外显子，SSCP检测第5外显子，最后结果经直接测序验证。结果：DGGE检测出17例异常泳动条带；测序结果证实该17例均存在1247A→G的SNP；SSCP检测到57例异常条带；经直接测序证实38例有2197T→G的SNP；PCR-限制性酶切结果与DGGE所测结果完全吻合。结论：DGGE检测结果无假阳性，重复性好，准确率高。而且可判断基因型；SSCP简便易行．但存在假阳性与假阴性，而且不能判断基因型；限制性酶切对SNP位点检测及基因分型均能进行较准确的判断。     

四引物扩增受阻突变体系PCR法检测慢性丙型病毒性肝炎患者白细胞介素-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性

目的建立四引物扩增受阻突变体系-PCR(amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)技术,检测河南地区慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者白细胞介素(interleukin,IL)-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分布情况。方法应用生物信息学软件设计IL-28B基因SNP rs8099917位点全长序列特异性四引物序列,建立ARMS-PCR技术;采集河南地区138例CHC患者外周血并提取DNA,行ARMS-PCR,PCR反应产物行体积分数1%琼脂糖凝胶电泳判定rs8099917位点基因型,并随机对20例患者标本中阳性条带的扩增产物进行直接测序确定基因型,评价ARMS-PCR的准确性。结果 ARMS-PCR成功建立;IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型为T/T型(252bp和182bp)、G/G型(252bp和131bp)和T/G型(252bp、182bp和131bp),电泳显示条带清晰,大小符合预期分子量,无非特异性条带扩增;138例CHC患者IL28B基因rs8099917位点SNP中T/T型105例(76.1%),G/G型4例(2.9%),T/G型29例(21.0%);以基因测序结果为标准,ARMS-PCR技术检测准确率为100%。结论河南地区慢性丙型病毒性肝炎患者IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型以T/T型为主,ARMS-PCR检测准确、简便经济、高效,适用于临床检测。     

福建畲族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型

目的研究福建畲族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变型特点，调查其G6PD缺乏症发生率及基因频率。方法用硝基四氮唑蓝（NBT）纸片法进行G6PD缺乏症定性筛查，用突变特异性扩增系统、错配碱基PCR介导酶切位点／限制性内切酶图谱分析、聚合酶链反应．单链构象多态性分析（PCR-SSCP）和DNA测序进行基因突变型鉴定结果在1820名青水畲族和764名穆云畲族人中，分别发现101例和104例酶活性异常，两地的致病基因频率分别为0．0607和0．1706。在穆云乡54例纯畲族血缘的样本中，共检出nt1376G→T突变38例、nt1388G→A突变12例、nt95A→G突变6例，三种基因突变型分别占70．3％，18．5％和11．1％；并发现1例nt1376G→T复合nt95A→G突变、1例nt1376G→T复合nt1388G→A突变。在青水畲族中发现6例nt1024C→T突变，占8．6％；发现1例392G→T突变，结论①nt1376G→T、nt1388G→A是幅建畲族中主要的基因突变型，中华民族具有共同的G6PD基因突变型，因而可能源于共同的祖先。②在畲族人群中发现nt1376G→T、nt1388G→A、nt95A→G、nt1024C→T和nt392G→T 5种基因突变型。③发现nt1376G→T复合nt95A→G突变、nt1376G→T复合nt1388G→A突变④nt95A→G是穆云畲族中另一种常见的基因突变型；1024C→T是青水畲族中常见的一种G6PD基因突变型。⑤明确青水畲族中G6PD基因频率为0．0607，穆云畲族中为0．1706，为上述地区G6PD缺乏症的防治提供决策参考。     

2型糖尿病线粒体ND1基因3个新突变位点的分析

目的 探讨线粒体DNA tRNA Leu（UUR）基因和ND1基因点突变（np 3243、3316、3394和3593）与湖北人群2型糖尿病的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP），克隆和测序的分析方法，对184例2型糖尿病患者和210名健康对照进行筛选，并用DNAMAN、Primer、mfold和Antherprot软件对检出的突变位点进行分析和二级结构预测。结果 实验组检出3316（G→A）突变6例（3．3％），3394（T→C）突变5例（2．7％），3593（T→C）突变1例（0．5％），并发现3个尚未见报道的新突变位点：3606（A→G）、3618（T→C）和3688（G→C），未检出3243（A→G）突变；对照组只检出3316（G→A）突变1例（0．5％）。两组间仅3394（T→C）突变率差异有统计学意义（P〈0．05）。3606（A→G）和3618（T→C）突变分别为亮氨酸、苯丙氨酸的无意义突变，其二级结构均与野生型ND1同；3316（G→A）突变（丙氨酸→苏氨酸），3394（T→C）突变（酪氨酸→组氨酸），3593（T→C）突变（缬氨酸→丙氨酸），3688（G→C）突变（丙氨酸→脯氨酸），均引起ND1因DNA和蛋白质二级结构的改变，其中3394（T→C）突变型变化最显著。结论 线粒体DNA ND1基因3394（T→C）突变以及3688（G→C）突变伴随3316（G→A）突变，可能与2型糖尿病的发生发展有关。     

单链构象多态性技术在家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因13外显子点突变筛查中的应用

目的 探讨单链构象多态性(SSCP)技术在家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体(LDLR)基因13外显子点突变筛查上的应用价值.方法 以16例临床诊断为家族性高胆固醇血症(FH)患者为研究对象,提取外周血DNA,扩增LDLR基因第13号外显子片段,组合最优条件进行SSCP电泳并银染.对异常条带进行DNA序列测定确定其突变性质和位置.结果 优化SSCP电泳条件为:不含甘油8%凝胶,在10℃条件下电泳;含5%甘油的8%凝胶,在常温条件下电泳(交联度均为49:1).凝胶厚度均不超过0.4 mm,电泳电压为5 V/cm,在此条件下进行SSCP电泳均可以得到满意电泳图谱.对发现的异常条带,结合DNA测序证实有4例患者LDLR基因第13外显子分别发生A606T,D601N,Y601D,或G636V错义突变,同时均存在1959碱基C→T同义突变.另外4例患者13外显子仅存在1959碱基C→T同义突变.结论 通过优化各种条件进行的PCR-SSCP银染方法,是高胆固醇血症病LDLR基因13外显子点突变初步筛查的有效手段.     

一例类孟买型表型的分子机理研究

为了研究1例类孟买型的分子机理,在血清学方法初步鉴定先证者为A类孟买型的基础上,用PCR扩增先证者ABO基因第6、7外显子、FUT1基因（H）和FUT2基因（Se）的编码区序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序分析,并应用PCR-SSP和基因扫描方法证实测序所发现的突变.FUT1基因突变通过克隆到质粒载体后测序分析.结果表明：直接测序发现先证者ABO血型基因型为A102A102,FUT1基因第682位A→G错义突变、第547-552位两碱基AG缺失（CAGAGAG→CAGAG）突变.克隆证实1条染色体上FUT1基因为A682G突变,导致M228V氨基酸突变;另一条染色体上第547-552位两碱基AG缺失,导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码.FUT2基因为分泌基因Se^357和弱分泌基因Se^357,385杂合（第357位为T/T纯合,385位为A/T杂合）.结论：FUT1基因A682G和547-552 delAG双杂合突变是引起该例先证者表现为类孟买型的分子机理,A682G是一个新的引起类孟买型的FUT1基因突变.     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA1311C→T复合11内含子93T→C突变

目的　探讨葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 (G6PD)基因cDNA1311C→T复合 11内含子 93T→C的突变与G6PD缺乏的关系。方法　运用硝基四氮唑蓝纸片法筛查G6PD患者 ,以定量法确诊 ,运用PCR SSCP筛查 11外显子异常的标本 ,以突变特异性扩增系统 (ARMS)法鉴定 1311C→T突变 ,DNA直接测序 1311突变标本的 11外显子和 11内含子。结果　在 12例 1311突变的标本中 ,在 11内含子的93位均发现有T→C突变。结论　cDNA1311C→T突变同时合并 11内含子的 93位T→C突变可能是G6PD缺乏患者酶活性降低的原因     

湖北汉族人群2型糖尿病患者线粒体基因突变检测及临床意义

目的研究线粒体DNA(mtDNA)16S rRNA基因(T3200C、C3206T)和ND1基因(A4136G、A4164G和T4216C)突变在湖北汉族2型糖尿病人群中的发生率及临床意义。方法采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)、PCR-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)分析及PCR产物直接测序,对175例2型糖尿病患者和200例正常对照的线粒体基因突变进行检测,并用Primer、Antherprot和Mfold软件对检出的突变位点进行分析,对RNA突变后最小自由能下的二级结构变化和ND1基因突变后蛋白质的二级结构改变进行预测。结果2型糖尿病组检出3200(T→C)突变2例(1．14％),3206(C→T)突变11例(6．28％),4216(T→C)突变3例(1．71％),4136位点未发现突变。发现2个未曾报道的新突变位点4164(A→G)7例(4．00％),4200(A→T)1例(0．57％)。对照组中检出3206(C→T)突变8例(3．92％),4164(A→G)突变5例(2．45％),两位点突变率在两组中比较差异无显著性(P>0．05)。RNA二级结构预测显示3200(T→C)突变引起16S rRNA基因最小自由能和二级结构的改变,可能引起疾病。4164(A→G)和4200(A→T)突变分别为Met和Leu的无义突变,4216(T→C)突变可使线粒体呼吸链中一个中性酪氨酸被亲水性组氨酸取代,蛋白质二级结构预测显示该突变可引起NDl蛋白质二级结构改变。研究还显示线粒体基因突变率在≥40岁个体呈上升趋势。结论mtDNA 3200(T→C)和4216(T→C)突变可能增加糖尿病的易感性;3206(C→T)和4164(A→G)为基因多态性改变;4136位点未发现突变。以上结果提示糖尿病的发生在线粒体基因突变上存在一定的异质性。     

2型糖尿病与线粒体tRNAleu(UUR)基因变异

目的探讨线粒体tRNA^leu（UUR）基因3243（A→G），3256（C→T），3290（T→C）3个位点的突变与武汉地区2型糖尿病的关系。方法采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对326名个体（156例2型糖尿病患者，170例健康对照）的线粒体tRNA^leu（UUR）基因3243（A→G），3256（C→T），3290（T→C）3个位点进行筛选，对突变位点用直接测序方法进行确证。结果两组均未检出3243（A→G），仅在糖尿病组检出3290（T→G）和3256（C→T）突变各1例。两组间突变频率差异无统计学意义。结论线粒体tRNA^leu（UUR）基因3243（A→G），3256（C→T），3290（T→C）突变可能不是武汉地区2型糖尿病的突变热点。     

一例凝血因子Ⅷ B区错义突变导致重型血友病A

目的：检测一例重型血友病Ａ患者（ＳＨ９）的基因突变。方法：用ＰＣＲ、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和ＤＮＡ测序检测因子Ⅷ基因突变。先用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ排除内含子２２倒位，然后应用ＰＣＲ对凝血因子Ⅷ基因进行扩增。扩增范围包括所有外显子及其侧翼内含子序列。结果：片段１４２在ＤＧＧＥ中泳动异常。ＤＮＡ测序证实Ｃ２５３５Ａ导致Ｂ区错义突变８２６Ａｓｐ（ＧＡＣ）→Ｇｌｕ（ＧＡＡ）。结论：该突变可能是导致重型血友病Ａ的原因，但有待进一步研究证实。     

维吾尔医学异常黑胆质体液结肠癌患者肠道菌群的分布情况研究

目的通过先进的分子生物学方法分析维吾尔医学异常黑胆质结肠癌患者肠道菌群分布情况及多样性。方法对结肠癌患者进行维吾尔医学体液分型并挑取其中异常黑胆质患者,采集患者粪便样品,提取细菌总DNA并设计一对通用引物扩增16SrDNA的V6~V8可变区进行变形梯度凝胶电泳(DGGE),从DGGE指纹图谱中比较各个结肠癌患者肠道菌群分布情况。结果通过试验得到了维吾尔族异常黑胆质结肠癌肠患者肠道菌群结构特征的DNA指纹图谱,从指纹图谱上选择一些特异性条带切下来回收,测序,测序出来的序列在基因库进行比对做出进化树了解菌群之间的亲缘性。结论异常黑胆质结肠癌患者肠道菌群基因序列的亲缘性结果显示肠道菌群的多样性明显少其中肠道优势菌比例低。     

p53基因在大肠癌发生转移及预后过程中的动态变化

背景肿瘤相关基因在癌瘤发生、发展、转移及预后过程中的作用如何一直是医学界研究的难点.目的了解变性梯度凝胶电泳(DGGE)和自动DNA序列分析方法检测肿瘤基因变异及p53基因、p53蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化,为大肠癌预后评估提供依据.设计以组织标本为研究对象的单一样本研究.单位一所军医大学医院肿瘤科.对象收集1994-01/2000-12解放军第一军医大学南方医院住院治疗的41例因大肠癌接受大肠根治性切除并于手术后5个月至5年内因肝转移接受肝切除术患者的大肠癌原发灶及肝转移灶标本.方法以DGGE及自动DNA序列分析法检测41例大肠癌原发病灶和肝转移灶p53外显子5～11的基因突变.以免疫组织化学方法检测p53蛋白表达.主要观察指标①p53基因突变在DGGE中的检出情况及突变.②p53基因的序列分析.③p53免疫组织化学染色结果.结果41例中24例有p53基因突变(62%),其中6例仅在肝转移灶发现p53基因突变,其余均为原发灶、转移灶有一致性的突变.另有3例原发灶即有p53基因突变的患者,在转移灶除保留原有突变外,还出现新增加的突变.在原发、转移灶同时有突变的16例中,14例呈现突变的p53碱基峰和正常峰之比在肝转移灶明显高于大肠癌原发灶(P＜0.001).p53免疫组织化学染色结果和DGGE,DNA序列分析结果高度一致.但在基因分析呈无义突变的癌灶,免疫组织化学显示p53蛋白的过度表达.结论在大肠癌肝转移过程中,p53基因突变主要开始于肠癌原发灶,并被保持于转移至肝脏的癌细胞内,在转移灶其含量或含突变型p53癌细胞量明显增加.p53基因突变与p53蛋白过度表达呈正相关关系.     

Detection of rpoB mutations associated with rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis using denaturing gradient gel electrophoresis

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to probe for mutations associated with rifampin (RIF) resistance in the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis. DGGE scans for mutations across large regions of DNA and is comparable to DNA sequencing in detecting DNA alterations. Specific mutations are often recognized by their characteristic denaturation pattern, which serves as a molecular fingerprint. Five DGGE primer sets that scanned for DNA alterations across 775 bp of rpoB were developed. These primer sets were used to scan rpoB for DNA alterations in 296 M. tuberculosis patient isolates from the United States-Mexico border states of Texas and Tamaulipas. The most useful primer set scanned for mutations in the rifampin resistance-determining region (RRDR) and detected mutations in 95% of the RIF-resistant isolates compared to 2% of RIF-susceptible isolates. Thirty-four different alterations were observed within the RRDR by DGGE. In addition, isolates harboring mixtures of DNA within rpoB were readily detected by DGGE. A second PCR primer set was used to detect the V146A mutation in 5 to 7% of RIF-resistant isolates. A third primer set was used to detect mutations in 3% of RIF-resistant isolates, some of which also harbored mutations in the RRDR. Only 1 of 153 RIF-resistant isolates did not have a detectable rpoB mutation as determined by DGGE and DNA sequencing. These results demonstrate the power and usefulness of DGGE in detecting mutations associated with drug resistance in M. tuberculosis.     

A gel electrophoresis method for detection of mitochondrial DNA mutation (3243 tRNALeu (UUR)) applied to a Norwegian family with diabetes mellitus and hearing loss

Blood cells of selected patients from a large Norwegian family with maternally transmitted diabetes mellitus, hearing loss and muscular dysfunction were screened for possible A3243G mutation tRNA^{Leu (UUR)} in mitochondrial DNA. We selected 7 patients from 3 of the 4 generations of the family and 10 unrelated healthy control subjects for mutation analysis using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and both manual and automated DNA sequencing. The A3243G mutation was found in peripheral blood cells of all 7 patients, but in none of the controls. The mutation was in the form of heteroplasmy and the amount of mutant DNA was found to be between 10% and 35% of total mtDNA in individual patients. This is the first report of a Norwegian family with maternally inherited diabetes and hearing loss carrying the A3243G mutation in mitochondrial DNA.     

A gel electrophoresis method for detection of mitochondrial DNA mutation (3243 tRNA(Leu (UUR))) applied to a Norwegian family with diabetes mellitus and hearing loss

Blood cells of selected patients from a large Norwegian family with maternally transmitted diabetes mellitus, hearing loss and muscular dysfunction were screened for possible A3243G mutation tRNA(Leu (UUR)) in mitochondrial DNA. We selected 7 patients from 3 of the 4 generations of the family and 10 unrelated healthy control subjects for mutation analysis using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and both manual and automated DNA sequencing. The A3243G mutation was found in peripheral blood cells of all 7 patients, but in none of the controls. The mutation was in the form of heteroplasmy and the amount of mutant DNA was found to be between 10% and 35% of total mtDNA in individual patients. This is the first report of a Norwegian family with maternally inherited diabetes and hearing loss carrying the A3243G mutation in mitochondrial DNA.     

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations in infertile males with congenital bilateral absence of the vas deferens

Congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD) is characterized by azoospermia and male infertility. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene are associated with cystic fibrosis (CF), the most common autosomal recessive disorder in Caucasians. Recent publications on CBAVD raised the question whether CFTR gene mutations are responsible for CBAVD occurrence or not. This study was conducted to explore the role of CFTR gene mutations in the occurrence of CBAVD-dependent male infertility. Forty-four chromosomes of 22 CBAVD patients from Austrian ancestry were studied. For detection of the most common mutation DeltaF508, a deletion of phenylalanine at the 508th position of mature CFTR chloride channel protein, the 10th exon of the gene was screened by heteroduplex analysis. In order to identify non-DeltaF508 mutations, we also analyzed the entire coding regions, exon/intron boundaries of 27 exons and the 5'- and 3'-untranslated regions of the gene by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) after polymerase chain reaction. All exons showing different banding patterns on the DGGE gels were sequenced to define existing DNA sequence variations. Among the analyzed 44 chromosomes of 22 patients, disease producing mutations were found in 31.8% (14/44). The most common mutation was DeltaF508 with a frequency of 43% (6/14), followed by R117H with 29% (4/14). Our results indicate that CFTR gene mutations are common but not the only reason for the occurrence of CBAVD-dependent male infertility. We recommend screening of the CFTR gene in these patients.     

变性梯度凝胶电泳检测到四例新的FⅨ基因突变

目的：研究凝血因子Ⅸ的基因突变。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）筛选技术，分析了１２例血友病Ｂ患者ＦⅨ基因的全部８个外显子，剪接区及３′，５′端部分非编码区，并对ＤＧＧＥ行为异常片段进行双脱氧链终止法ＤＮＡ序列分析。结果：发现４例新的基因突变，分别位于ＦⅨ基因第１号外显子Ｔ（ＴＧＴ）１１１Ｇ（ＧＧＴ），导致Ｃｙｓ－１９Ｇｌｙ；第３号内含子剪接位点Ｃ１０３８０Ｔ和第８号外显子Ａ（ＴＡＣ）３０９１８Ｇ（ＴＧＣ），导致Ｔｙｒ２６６Ｃｙｓ；第８号外显子Ａ（ＡＣＧ）３１００７Ｃ（ＣＣＧ），导致Ｔｈｒ２９９Ｐｒｏ。结论：阐明血友病Ｂ的点突变有助于进一步了解ＦⅨ蛋白各功能域的精细功能，并为血友病Ｂ家系携带者检测和产前诊断提供了一个重要的遗传信息。     

Identification of the multiple beta-thalassemia mutations by denaturing gradient gel electrophoresis.

We used denaturing gradient gel electrophoresis to detect the beta-thalassemia mutations in the Chinese population. By amplifying the beta-globin gene in four separate fragments and electrophoresing the amplified DNA in two gels, we were able to distinguish all the 12 known mutations on the basis of the mobility of the homoduplexes and heteroduplexes. We conclude that denaturing gradient gel electrophoresis offers a nonradioactive means of detecting multiple mutations in genetic disorders.     

上海,江苏,浙江血友病甲基因突变的检测

目的：对血友病甲进行基因诊断。方法：采用多聚酶链反应（PCR），变性梯度凝胶电泳（DGGE）和DNA测序等方法对上海地区血友病甲基因突变进行检测。50例无内含子22倒位的血友病甲患者（其中重型24例，中型9例，轻型17例，无亲缘关系患者45例）先用PCR扩增基因组DNA，扩增范围包括所有外显子［编码B区的外显子14（氨基酸783～1598）部分除外，但包含凝血酶切割位点AA740和1689］及其侧翼内含子序列，然后对扩增片段进行DGGE分析，发现异常条带则进行DNA测序。结果：11例无亲缘关系患者中检出突变11种，其中无义突变5种，均为重型；错义突变5种，均为轻、中型；小缺失1例。其中，466Lys（AAG）－Thr（ACG），719Tyr（TAC）－Stop（TAG）及312Ile（ATC）－xxC为新发现的突变。结论：除内含子22倒位外，绝大部分血友病甲基因突变为单碱基置换导致的点突变。有亲缘关系的患者都有相同的基因突变。基因突变与临床表现基本相符。