多种生长因子对胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的诱导作用

目的: 探讨转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)、TGFβ1 DNCP、肝素 胰岛素样生长因子1(IGF-1)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.方法:取妊娠12.5 d SD大鼠胎鼠颌突外胚间充质细胞(第4代),在转化生长因子β1(TGFβ1)(2 ng/mL)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)(100 μg/mL)、TGFβ1(2 ng/mL) DNCP(100 μ/mL)、肝素(1 μg/mL) IGF-1(100 ng/mL)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索生长因子在外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.结果:6 d后,在DNCP、TGFβ1 DNCP作用下,胎鼠面突外胚间充质细胞出现明显的形态改变,细胞由成纤维样变为梭形,部分核极化,有很长的突起,部分细胞呈现平行排列趋势.TGFβ1组部分细胞出现极化改变.DNCP、TGFg 1 DNCP诱导组抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应,RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP),另外DMP1亦呈阳性表达.TGFβ1组不表达DSPP、DMP1.肝素 IGF-1组在细胞形态和蛋白、mRNA上均未出现成牙本质细胞特异的表达.结论:胎鼠面突外胚问充质细胞在DNCP和TGFβ1 DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.表明在诱导中起关键作用的是DNCP.TGFβ1可诱导细胞在形态学上分化成类成牙本质细胞.本结果与该细胞在三维体系中的诱导分化结果相似,表明胚胎面突外胚间充质细胞在体外被诱导分化为成牙本质样细胞不是偶然现象,这为研究牙齿的分化和发育提供了良好的模型和实验依据.     

颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化

外胚间充质细胞具有多向分化潜能．它可以进一步分化为成牙本质细胞等多种细胞。并将形成上下颌骨、最下颌关节盘软骨、牙本质、牙髓、牙骨质、牙周韧带、听神经等组织器官。该细胞在牙齿发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作甩。本文从外胚间充质细胞的起源和特性、颌突外胚间充质细胞的分离和体外培养、外胚间充质细胞的定向诱导分化、外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化、诱导分化的成牙本质细胞的鉴定等方面进行了综述。     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚问充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨人胚胎面突外胚间允质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。方法：采用体外细胞三维立体培养的方法，在转化生长因子B1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法，探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用。结果：人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好。培养4d，在TGFβ1 DNCP组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。碱性磷酸酶活性增强。细胞在矿化液中能形成矿化结节。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSFP)。结论：三维立体培养下，人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFB1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。本结果将外胚间充质干细胞作为前体，诱导分化出成牙本质样细胞，为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据。     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的: 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.方法:采用体外细胞三维立体培养的方法在转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用.结果:人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好.培养4 d在TGFβ1+DNCP组中细胞出现核极化有很长的突起细胞平行排列.诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.碱性磷酸酶活性增强.细胞在矿化液中能形成矿化结节.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP).结论:三维立体培养下人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFβ1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.本结果将外胚间充质干细胞作为前体诱导分化出成牙本质样细胞为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据.     

大鼠外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞定向诱导分化--三维诱导模型的建立

目的：探讨大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化的机制。方法：以胶原作为支架，建立外胚间充质细胞三维培养模型，并在培养液中加入10ng／mlbFGF和(或)100ng／mlIGF-1等生长因子，观察和检测细胞表型的变化。结果：经bFGF和IGF-1诱导4d后，在胶原的周边细胞出现平行排列的具有细长单极突起的成牙本质细胞样细胞，通过免疫组化抗DSP抗体染色阳性。而其余组细胞排列较紊乱，抗DSP染色阴性。结论：含有bFGF和IGF-1的三维诱导模型可诱导大鼠外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化，为研究牙齿发育的分子机制奠定了基础。     

颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化

外胚间充质细胞具有多向分化潜能。它可以进一步分化为成牙本质细胞等多种细胞,并将形成上下颌骨、颞下颌关节盘软骨、牙本质、牙髓、牙骨质、牙周韧带、听神经等组织器官。该细胞在牙齿发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作用。本文从外胚间充质细胞的起源和特性、颌突外胚间充质细胞的分离和体外培养、外胚间充质细胞的定向诱导分化、外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向误导分化、诱导分化的成牙本质细胞的鉴定等方面进行了综述。     

人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞的诱导分化

目的:建立人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化的体外诱导方案。方法:应用bFGF IGF 1或TGF β1分别对培养早期的人牙源性间充质细胞进行平面定向诱导,观察诱导后细胞的形态学改变,采用免疫荧光染色和RT PCR方法检测成牙本质细胞标志物———DSP蛋白和DSPPmRNA在诱导后细胞中的表达,并通过VonKossa染色检测诱导后细胞的矿化能力。结果:诱导后部分细胞出现单侧较长的细胞突起,表达DSP蛋白和DSPPmRNA,体外连续培养可自发形成矿化结节,出现较典型的成牙本质细胞的形态和功能特征。结论:bFGF IGF 1或TGF β1可促进牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化。     

Apical bud上皮诱导脂肪间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的研究

目的:通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apical bud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源间充质干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、Apical bud上皮细胞,制备Apical bud上皮条件诱导液并体外对ADSCs诱导7d,通过实时定量PCR方法检测成牙本质关键基因DMP-1及DSPP的表达。制备ADSCs及Apical bud上皮重组细胞团进行大鼠肾被膜下移植,8W后取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果:Apical bud上皮诱导ADSCs后DMP-1及DSPP m R NA表达水平显著高于对照组。体内移植8W后H E染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构,Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构,免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论:Apical bud上皮细胞在体外能够诱导ADSCs向成牙本质细胞分化,且细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。     

碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响,为研究颅面与牙齿的发育机制及外胚间充质干细胞的诱导分化提供理论依据。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测经 10 ng/ml bFGF、100 ng/ml IGF-1刺激4 d后大鼠外胚间充质干细胞的吸光度值。结果 培养4 d后,bFGF处理组吸光度值高于对照组(P<0.05),而IGF-1组及bFGF+IGF-1组与对照组差异均无显著性(P>0.05)。结论 bFGF可促进大鼠外胚间充质于细胞的增殖,bFGF和IGF-1可能协同促进其分化。     

SD大鼠面突未分化外胚间充质细胞的体外培养

目的 建立SD大鼠面突未分化我胚间充质细胞的体外培养模型。方法 采用消化贴壁法培养SD大鼠外胚间充质细胞；用倒置显微镜观察细胞生长特性；用免疫组化法鉴定细胞来源。结果 细胞呈纤维样细胞生长，生长稳定。免疫组化染色，抗HNK－1和抗VIM为阳性，抗CK为阴性。结论 培养的细胞为外胚间充质细胞，为研究颌面及牙齿的发育提供了实验基础。     

大鼠颌突外胚间充质细胞向骨骼肌细胞诱导分化和三维培养观察

目的：探讨体外诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化的潜能，利用分化细胞构建组织工程骨骼肌模型。方法：取妊娠10．5d胎鼠颌突外胚间充质细胞，纯化后分别在含1、5、10mL／L体积浓度二甲基亚砜的DMEM／F12培养基中培养。相差显微镜下观察细胞的形态变化，成肌相关因子免疫组化鉴定细胞性质，将诱导后的细胞种植于胶原膜，并于培养3、6d后用光镜、扫描电镜观察细胞的生长情况。结果：培养3d后，外胚间充质细胞形态出现成肌样细胞变化，细胞变得大而扁平，培养5d后细胞出现管样结构。免疫组化鉴定显示：添加二甲基亚砜后，大部分细胞出现成肌相关因子的表达，其中5mL／L实验组效果最好，约75％的细胞转化为骨骼肌细胞。对照细胞形态未见明显改变，免疫组化鉴定未能诱导分化出骨骼肌细胞。种植于BAM膜后，细胞生长良好，并可形成复层结构。结论：二甲基亚砜可诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化，最佳浓度为5mL／L；在BAM膜上分化细胞生长状态良好，说明该生物可降解膜是构建组织工程骨骼肌的适合材料。     

大鼠上下颌突未人化外胚间充质细胞的体外培养

目的：建立体外培养大鼠上下颌突未分化外胚间充质细胞的方法。方法：于饲养细胞上用组织块培养法作原代培养细胞;免疫组织化学法鉴定细胞来源。结果：培养的细胞呈单层贴壁生长,细胞起源鉴定为外胚间充质细胞。结论：建立了一种简便培养大鼠未分化外胚间充质细胞的方法,为下一步的研究工作奠定基础。     

Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞向成骨细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨矿化液体外诱导外胚间充质细胞向成骨细胞分化的过程。方法：取妊娠12．5d胎鼠第三代下颌突外胚间充质细胞，培养于含10mmol／L β-甘油磷酸钠、100μg/mL维生素C、10nmol／L地塞米松、150mL／L胎牛血清的DMEM中。相差显微镜下观察细胞的形态变化，免疫组化鉴定细胞性质，碱性磷酸酶染色及活性检测，矿化结节Von Kossa染色。结果：培养14d，细胞形态发生明显变化，呈多边形、立方形，抗I型胶原染色阳性。碱性磷酸酶活性增高，碱性磷酸酶染色阳性，矿化结节形成。结论：矿化液可诱导外胚间充质细胞向成骨细胞分化。     

酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突未分化外胚间充质细胞

目的：用酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞，并与组织块法相比较，研究其形态和生长特性。方法：采用1.25g/L的胰酶消化法获取E12.5d Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞，用含10^6U/L LIF的D／F12培养细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，免疫组化鉴定细胞来源及分化状况。结果：培养的细胞呈单层生长，长梭形，有2－4个突起，抗HNK－1、Vimentin、S－100、NSE染色阳性，抗GFAP、NF、MA染色阴性，证实为未分化外胚间充质细胞。结论：用酶消化法可在短期内获得大量的未分化外胚间充质细胞。     

大鼠外胚间充质干细胞的体外生长特性及促进造血恢复的研究

目的:了解大鼠外胚间充质干细胞(EMSC)的生物学特性,探索体内输入EMSC能否促进照射动物造血功能的恢复。方法:取E11.5SD大鼠胚胎颌突,消化法培养获得外胚间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况,免疫组化鉴定细胞来源;雄性SD大鼠(180～220g)分为外胚间充质干细胞组(A组)、照射对照组(B组)、成纤维细胞组(C组)、正常对照组(D组),前三组给予60Coγ射线全身照射,剂量6.0cGy,动态观察大鼠外周血变化,并于第4周检测骨髓有核细胞数量;测定大鼠骨髓细胞粒—巨噬细胞(CFU-GM)形成能力;采用内源性脾结节法测定脾集落形成能力。结果:培养的细胞呈单层生长,成纤维状、长梭形、有2～4个突起,抗HNK1、Vi mentin、S-100、NSE染色阳性,抗GFAP、NF、MA染色阴性,证实为未分化外胚间充质细胞;体内植入EMSC能够明显促进大鼠放射后外周血白细胞和血红蛋白的恢复,增加骨髓有核细胞数,减少骨髓造血细胞的坏死、凋亡,促进骨髓细胞的CFU GM的形成率并能有效地支持造血细胞增殖、分化。结论:EMSC具有干细胞特征,能促进照射大鼠造血功能的恢复。     

外胚间充质干细胞永生化的实验研究

目的：探讨端粒酶催化亚基(hTERT）在外肌间充质十细胞永生化中的作用。方法：质粒pClneo—hTERT转染外胚问充质干细胞，经G418筛选后获得抗性克降。免疫细胞化学法及图像分析检测hTERT的表达，累计生长曲线检测细胞增殖能力。结果：转染后获3个抗性克隆。转染第3代细胞hTERT染色呈强阳性，转染后第15代细胞hTERT活性较正常培养的第15代细胞明显增强、转染细胞增殖能力有不同程度的增加，其中克隆2越过衰老期，寿命延长。结论：外源性hTERT介入可重建外胚间充质干细胞的端粒酶活性，使细胞延长寿命，得以永生。     

釉基质蛋白对大鼠外胚间充质细胞黏附、伸展影响的体外研究

目的：了解体外研究环境中，两种不同形式釉基质蛋白（粗提型EMPs和纯化型EMD）对外胚间充质细胞黏附、伸展行为的影响力。方法：酶消化法培养SD大鼠颌突外胚间充质细胞，采用固相结合分析方法，观察外胚间充质细胞在不同浓度釉基质蛋白（50、100、150及200μg／mL等浓度的EMPs和EMD）包被的培养孔表面黏附、伸展情况，依次命名为ED2、ED2、ED3、ED4及EP1、EP2、EP3、EP4组。结果：①细胞黏附性实验中，仅ED2和ED3组结果高于空白对照组（P〈0．01）。②细胞伸展实验中，EP1、EP2和EP3组结果高于空白对照组（P〈0.01）。结论：EMD对外胚间充质细胞伸展无明显促进作用，但可显著促进其黏附贴壁；EMPs对外胚间充质细胞黏附无影响，但可促进其伸展。     

人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的 :观察人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法 :分对照组和实验组 ,对照组是转染不含目的基因的空白质粒 pcDNA3的培养上清 ,实验组是转染pcDNA3 -hDSP重组质粒的培养上清。取第 5代人牙乳头间充质细胞 ,接种于 96孔板 ,对照组 6孔 ,实验组 10孔 ,用MTT法检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响 ,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 :hDSP能明显抑制体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖 (P <0 .0 1) ,但能促进细胞内和培养上清中碱性磷酸酶的分泌 (P <0 .0 1)。结论 :hDSP能促进人牙乳头间充质细胞的分化和矿化